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他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响.pdf
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1、332实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant(ElectronicVersion),July2023,Vol.11,No.4论著 移植免疫他克莫司对肝移植急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响林玲1,袁梦淑1,田小荣1,王玉鑫1,曹欢1,吴龙龙2,田轩2,左怀文1,张新如1,宋红丽3(1.天津医科大学一中心临床学院,天津 300192;2.南开大学医学院,天津 300074;3.天津市第一中心医院器官移植科,天津市器官移植重点实验室,天津市器官移植临床医学研究中心,天津 300192)【摘要】目的 探讨他克莫司对心脏死亡器官捐献(do
2、nation after cardiac death,DCD)供肝移植后急性排斥反应大鼠肠道菌群的影响。方法 构建稳定运行的常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP)系统。夹闭 Lewis 大鼠胸主动脉 30 min 获取 DCD 肝脏,以棕色挪威大鼠(BN)为受体,建立原位肝移植急性排斥反应模型。根据对肝脏的不同处理方法,将 BN 大鼠分为以下 3 组:假手术(Sham)组、单纯NMP(NMP)组及 NMP 联合术后他克莫司(FMP)组,每组 6 只,术后 14 d 收集血液、肝脏和肠道内容物样本。血液标本检测肝功能,HE 染色观察肝脏组织学变化并计
3、算排斥活动指数(rejection activity index,RAI),16 SrDNA 检测肠道内容物,观察各组肠道菌群结构、多样性及功能变化。结果 FMP 组(中位生存期 60 d)大鼠存活时间较 NMP 组(中位生存期为 16.5 d)延长,肝功能和肝组织病理较 NMP 组显著改善(P 0.05)。计算 RAI 结果显示,FMP 组(2.001.23)显著低于 NMP 组(7.601.14)(P 0.05)。与 NMP 组相比,FMP组肠道菌群丰度下降,两组在物种之间有明显差异,FMP 组富含厚壁菌门、阿克曼菌科和毛螺菌科,且富集其他聚糖降解和鞘脂代谢通路。结论 他克莫司能够改善 D
4、CD 供肝移植后急性排斥反应大鼠肝损伤,同时调节肠道菌群结构和代谢途径。【关键词】大鼠;肝移植;他克莫司;常温机械灌注;心脏死亡器官捐献;急性排斥反应;肠道菌群Effect of tacrolimus on intestinal flora in rats with acute rejection after liver transplantationLin Ling1,Yuan Mengshu1,Tian Xiaorong1,Wang Yuxin1,Cao Huan1,Wu Longlong2,Tian Xuan2,Zuo Huaiwen1,Zhang Xinru1,Song Hongli3
5、.1.Tianjin Medical University,First Central Clinical College,Tianjin 300192,China;2.Nankai University,School of Medicine,Tianjin 300074,China;3.Tianjin First Central Hospital,Department of Organ Transplantation,Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation,Tianjin Organ Transplantation Clinical Me
6、dical Research Center,Tianjin 300192,China.Corresponding author:Song Hongli,Email: 【Abstract】Objective To investigate the effect of tacrolimus on intestinal flora in donation after circulatory death(DCD)rats with acute rejection after liver transplantation.Methods To establish a stable normothermic
7、machine perfusion(NMP)system.The thoracic aorta of Lewis rats was clamped for 30 minutes to obtain the DCD livers.The acute rejection model of orthotopic liver transplantation was established with brown norway(BN)rats as recipients.According to different treatment methods of liver,BN rats were divid
8、ed into the following three groups:sham operation DOI:10.3969/j.issn.2095-5332.2023.04.009 基金项目:国家自然科学基金(82070639,81670574)通讯作者:宋红丽,Email:333实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant(ElectronicVersion),July2023,Vol.11,No.4提供,实验流程遵循实验动物伦理规定,并经天津市第一中心医院伦理委员会许可,批号为2016-03-A1。1.2 建立 NMP 系统:根
9、据前期研究7,NMP 系统由器官腔、膜式氧合器、蠕动泵、温度和压力传感器、过滤器和热交换器组成。灌流液总体积为 80 ml,主要成分为 60 ml 含 20%胎牛血清和 1%青链霉素混合液的 DMEM/F12 培养液、20 ml 大鼠自体全 血、肝素(5 U/ml)、地塞米松(2.5 g/ml)和胰岛素(1 U/ml)。1.3 大鼠原位肝移植急性排斥模型建立及分组:Lewis 大鼠为供体,BN 大鼠为受体,利用“二袖套”法建立大鼠肝移植手术模型8,具体参考文献9。实验动物被随机分为 3 组:假手术(Sham)组、单纯机械灌注(NMP)组及他克莫司(FMP)组。Sham 组大鼠仅开腹游离肝脏韧带
10、,不阻断肝脏供血,30 min 后关腹。NMP 组供肝仅进行 NMP。FMP 组供肝单纯进行 NMP,并在移植术后每天以 0.1 mg/kg的剂量灌胃。每组 6 只,术后 14 d 收集血液、肝脏和肠道内容物样本进行检测。1.4 肝脏病理学:肝脏样本固定 24 48 h 后进行脱水、石蜡包埋及切片等步骤处理后进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,显微镜下观察,按 Banff 标准统计排斥活动指数(rejection activity index,RAI),评估组织病理学变化。1.5 肝功能测定:血液样本在室温下进行离心机离心,3000g,10 min 后获得
11、血清样本,使用全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(alanine 目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效治疗手段,由于供肝的持续短缺,心脏死亡器官捐献(donation after circulatory death,DCD)肝脏被广泛应用于移植手术中1。现有的静态冷藏技术作为保存 DCD 供肝的方式常导致术后并发症的高风险和高病死率2。我们前期研究发现,相较于静态冷保存,常温机械灌注(normothermic machine perfusion,NMP)可有效缓解 DCD 供肝移植过程中的缺血/再灌注损伤3。急性排斥反应是影响移植预后的严重并发症,免疫抑制剂的广泛应用能够有效预防排斥反应的发生,
12、然而与免疫抑制相关的短期和长期风险,如感染、恶性肿瘤、心血管疾病、代谢紊乱及其他并发症也不容忽视4-5。肝脏与肠道之间通过胆道、门静脉和体循环紧密连接6,因此本研究在使用 NMP 系统保存肝脏的基础上,欲探究常用免疫抑制剂他克莫司对于肝移植急性排斥大鼠发挥保护肝脏作用时对肠道菌群的影响,为他克莫司在器官移植领域的安全合理用药提供更充分的指导资料。1 对象与方法1.1 实验材料:他克莫司(安斯泰来制药有限公司,沈阳,中国)。雄性 Lewis 大鼠 12 只,7 8 周龄,200 220 g 为供体;雄性棕色挪威大鼠(brown norway,BN)大鼠 18 只,8 9 周龄,220 240 g
13、为受体,用于制备大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。以上实验动物由军事医学科学院实验动物中心(Sham)group,simple NMP(NMP)group and NMP combined with postoperative tacrolimus(FMP)group,with 6 rats in each group.Blood,liver and intestinal content samples were collected 14 days after operation.The liver function of blood samples was detected,the histo
14、logical changes of liver were observed by HE staining,and the rejection activity index(RAI)was calculated.The intestinal contents were detected by 16SrDNA,and the changes of intestinal flora structure,diversity and function in each group were observed.Results The survival time of rats in FMP group(m
15、edian survival time 60 d)was longer than that in NMP group(median survival time 16.5 d),and the liver function and liver histopathology were significantly improved than those in NMP group(P 0.05).The results of RAI showed that FMP group(2.001.23)was significantly lower than NMP group(7.60 1.14)(P 0.
16、05).Compared with the NMP group,the abundance of intestinal flora in the FMP group was significantly decreased(P 0.05),and there were significant differences between the two groups.FMP group was rich in Firmicutes,Akkermansiaceae and Lachnospiraceae,as well as the other glycan degradation and sphing
17、olipid metabolism pathways.Conclusion Tacrolimus can improve liver injury in rats with acute rejection after transplantation,and regulate the structure of intestinal flora and metabolic pathway.【Key words】Rat;Liver transplantation;Tacrolimus;Normothermic machine perfusion;Donation after circulatory
18、death;Acute rejection;Intestinal flora334实用器官移植电子杂志 2023 年 7 月第 11 卷第 4 期 PracJOrganTransplant(ElectronicVersion),July2023,Vol.11,No.4aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和总胆红素(total bilirubin,TBil)的水平。1.6 粪便 16 SrDNA 分析:收集大鼠回盲部肠道 内容物,立即浸入液氮冻存,随后存放于-80 低温冰箱进行保存,密闭无菌便盒收集的盲肠内容物
19、送至北京博奥晶典生物技术有限公司行高通量 测序。1.7 统计学分析:采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以均数 标准差(xs)表示,采用成组 t 检验或单因素方差分析,P 0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 NMP 系统和大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立:建立了稳定运行的 NMP 系统(图 1A)。术后 14 d 肝脏组织 HE 结果显示:正常大鼠肝脏组织结构完整,未见明显异常(图 1B)。而急性排斥反应模型大鼠肝脏汇管区及中央静脉内皮细胞下有炎症细胞浸润(图 1C),证明急性排斥反应模型建立成功。(图 3D)。结果表明,他克莫司治
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