树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析.pdf
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1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 88 树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析 孙华军,刘盈,李雪静,杨斯琪,钱丽丽,李跃*(黑龙江八一农垦大学食品学院,黑龙江大庆 163316)摘要:苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶,能调节树莓中黄酮类的生物合成。为了深入研究树莓中 RiPAL1 基因的功能与调控机制,以树莓果实为材料提取总 RNA,合成 cDNA 第一链,然后成功克隆出树莓果实RiPAL1基因,并对其进行了相关的生物信息学分析。结果表明
2、,RiPAL1基因的编码序列(Coding Sequence,CDS)全长为2 133 bp,编码710 个氨基酸,分子量为77.50 ku,等电点为 6.21。RiPAL1 蛋白疏水性最大值为 4.50,最小值为-4.50,平均疏水指数为-0.49,为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽。含有 4 个 N 糖基化位点和67 个特异性激酶位点,二级结构以 螺旋为主,三级结构为同型四聚体。多序列比对显示 RiPAL1 蛋白具有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域,系统进化分析表明 RiPAL1 蛋白与同科植物草莓亲缘关系最近。该研究可为深入研究 RiPAL1 基因参与树莓果实黄酮类物质生物合成的分子机制提
3、供参考。关键词:树莓;苯丙氨酸解氨酶(PAL);基因克隆;生信分析;黄酮 文章编号:1673-9078(2023)09-88-95 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.9.1190 Cloning and Bioinformatics Analysis of RiPAL1 Gene of Raspberry SUN Huajun,LIU Ying,LI Xuejing,YANG Siqi,QIAN Lili,LI Yue*(College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daq
4、ing 163316,China)Abstract:Phenylalanine ammonia-lyase(PAL)is a key enzyme in the metabolism of phenylpropane that regulates the biosynthesis of flavonoids in raspberry.To elucidate the function and regulation mechanism of the RiPAL1 gene in raspberry,total RNA was extracted from raspberry fruits to
5、synthesize first-strand cDNA.The gene was successfully cloned,and related bioinformatics analyses were carried out.Our results showed that the coding sequence(CDS)of the RiPAL1 gene was 2 133 bp in length,encoding 710 amino acids,with a molecular weight of 77.5 ku and an isoelectric point of 6.21.Th
6、e maximum hydrophobicity of RiPAL1 protein was 4.50,its minimum hydrophobicity was-4.50,and its average hydrophobicity index was-0.49.Based on these,it was determined that it is a hydrophilic protein with no transmembrane structure and no signal peptide.The RiPAL1 protein contained 4 N-glycosylation
7、 sites and 67 specific kinase sites.Its secondary structure was mainly composed of-helices,while its tertiary structure was a homotetramer.Multiple sequence alignment showed that the RiPAL1 protein has a typical conserved domain of phenylalanine ammonia-lyase.Phylogenetic analysis indicated that the
8、 RiPAL1 protein is closely related to that of strawberry.This study provides a reference for further research on the molecular mechanism of the RiPAL1 gene in the biosynthesis of flavonoids in raspberry fruit.Key words:raspberry;phenylalanine ammonia-lyase(PAL);gene cloning;bioinformatics analysis;f
9、lavonoids 引文格式:孙华军,刘盈,李雪静,等.树莓 RiPAL1 基因克隆及生物信息学分析J.现代食品科技,2023,39(9):88-95 SUN Huajun,LIU Ying,LI Xuejing,et al.Cloning and bioinformatics analysis of RiPAL1 gene of raspberry J.Modern Food Science and Technology,2023,39(9):88-95 树莓(Rubus idaeus L.)属于蔷薇科(Rosaceae)收稿日期:2022-09-19 基金项目:黑龙江省自然科学基金联合引导
10、项目(LH2021C067);黑龙江八一农垦大学引进人才科研启动基金(XYB202102);黑龙江八一农垦大学大学生创新创业训练计划项目(S202210223002)作者简介:孙华军(1992-),女,博士,讲师,研究方向:果蔬采后贮藏保鲜及加工,E-mail: 通讯作者:李跃(1992-),男,博士,讲师,研究方向:果蔬采后贮藏保鲜及加工,E-mail: 悬钩子属多年生小灌木,又称覆盆子、托盘、木莓等1。成熟的树莓果实色泽宜人、酸甜适口、软嫩多汁,富含多酚、类黄酮和花青素等多种有益活性成分及人体必需的氨基酸,具有增强免疫力和抗癌的功效2-4。由于富有极高的营养价值,树莓也被誉为“第三代黄金水
11、果”5,6。苯丙烷代谢途径是植物重要的次级代谢途径之一,该途径会产生多种活性成分,如黄酮、多酚和花 青 素 等7。苯 丙 氨 酸 解 氨 酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase,PAL)是苯丙烷代谢途径的关键酶和现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 89 限速酶,通过催化 L-苯丙氨酸产生反式肉桂酸,反式肉桂酸是植物合成黄酮类等次级代谢产物的前体物质,是调控下游黄酮类成分合成信号通路的关键成 员8。黄酮类化合物是一类重要的次生代谢天然有机化合物,具有抗氧化等生物学功能,可清除体内的自由基和毒素,
12、能抗菌、消炎、抗肿瘤,对人体健康大有裨益9。树莓中含有丰富的黄酮类和花色苷等酚类物质,对预防心血管疾病和肿瘤等有良好效果10,11。FAO 推荐其为“生命之果”12。研究表明,PAL 与黄酮积累有关,刘金福等13研究发现,苦荞黄酮的产生与 PAL 活性呈正相关。赵则海等14对攀援型和矮生型四棱豆的苯丙氨酸解氨酶活性和黄酮含量进行了比较,发现在两种不同类型的四棱豆中,PAL 活性和总黄酮含量之间均呈显著正相关。在树莓中,一氧化氮处理能通过增强 PAL 和其他相关酶活性,加快黄酮和总酚的积累速率,提升果实的抗氧化能力15。目前,已对云锦杜鹃16、百蕊 草17、牛大力18和陆地棉19等多种植物的 P
13、AL 基因进行了克隆、序列分析以及蛋白质的功能研究,而有关树莓 PAL 基因的研究报道仍较少。关于树莓中黄酮类次生代谢物的代谢机制和调控机理尚未深入研究,研究调控树莓黄酮类代谢的关键基因的序列和结构等信息,对于阐明树莓类黄酮的代谢机理至关重要。因此,本研究根据前期树莓转录组数据,采用逆转录多聚酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法克隆获得 RiPAL1 基因序列,利用生物信息学分析软件对该基因进行生物信息学分析,明确 RiPAL1 基因的序列、结构和亲缘信息,以期为研究树莓 RiPAL1 基因在黄酮类物质生物合
14、成中的转录调控作用机制提供理论基础。1 材料与方法 1.1 原料 树莓果实采自于黑龙江省尚志县浆果基地,采摘后立即运回实验室,用液氮快速冷冻后于-80 保存。1.2 主要仪器设备 RNA 提取试剂盒,康为世纪生物科技有限公司;cDNA 逆转录试剂盒和 23 G Taq Master Mix,南京诺唯赞生物科技股份有限公司;引物合成和测序技术服务由金唯智生物科技有限公司提供。1.3 试验方法 1.3.1 树莓果实 RNA 提取及 cDNA 第一链的合成 从-80 冰箱中取出树莓果实样品,于液氮中迅速研磨成粉末状,参照 CWBIO OminiPlant RNA Kit(DNAse I,适用于多糖多
15、酚)试剂盒说明书提取总RNA。再参照 HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis 试剂盒说明书合成 cDNA 第一链。1.3.2 树莓 RiPAL1 基因的克隆 从本实验室已有的树莓转录组数据中获得RiPAL1 基因序列,用 primer premier 6.0 软件设计RiPAL1 基因的特异性引物(F:ATGGAGTTTAATAAA AACGGC;R:TTAAGATATAGGCAGGGG)。PCR扩增反应体系为50 L,包含25 L的23G Taq Master Mix,2 L 上游引物,2 L 下游引物,1 L 树莓果实cDNA,20 L 灭菌水。PCR
16、反应的条件为:95 预变性 3 min;95 变性 15 s,55 退火 15 s,72 延伸 3 min;共 33 个循环,72 彻底延伸 5 min,4 保存。PCR 产物用 1%(m/m)的琼脂糖凝胶电泳检测。目的条带单一且明亮则送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。1.3.3 树莓 RiPAL1 基因的生物信息学分析 测序无误的树莓 RiPAL1 基因序列用 ORF finder 软件预测其完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。在线预测树莓 RiPAL1 基因编码氨基酸的蛋白保守结构域及超家族。利用在线软件预测树莓RiPAL1 基因编码蛋白理化性质(Expasy
17、ProtParam)、信号肽(SignalP 4.1)、跨膜结构(TMHMM 2.0)、糖基化位点(NetNGlyc 1.0)、磷酸化位点(NetPhos 3.1)和亲疏水性(ExPasy-ProtScale)并进行分析。使用 SOPMA 软件(http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测蛋白二级结构,使用 SWISS-MODEL 软件预测蛋白三级结构。通过 DNAMAN 软件进行氨基酸多序列比对,采用MEGA 7软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树。1.3.4 数据分析 在 N
18、CBI blastn 中比对 PCR 产物测序后得到的基因序列,并命名为树莓 RiPAL1 基因。使用 NCBI中的 BlastP 工具查找与树莓 RiPAL1 同源性较高的蛋白。现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 90 2 结果与分析 2.1 树莓 RiPAL1 基因的克隆及序列分析 提取树莓果实 RNA 后,将其逆转录为 cDNA 第一链。以cDNA 为模板,F(ATGGAGTTTAATAAAAAC GGCAAC)和R(TTAAGATATAGGCAGGGGGGCAC)为引物进行RiPAL1 基因的全长扩增,电
19、泳结果显示在2 000 bp 偏上处有条带单一的高亮度目标条带(图1)。将剩余的 PCR 产物进行测序,得到全长为 2 133 bp的基因序列,经NCBI blastn比对后命名为树莓RiPAL1基因。利用 ORF finder 确定 RiPAL1 基因的开放阅读框为 2 133 bp(图 2a),编码710 个氨基酸(图 2b)。图 1 树莓RiPAL1基因 PCR 扩增产物电泳 Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of RiPAL1 gene in respberry 图 2 RiPAL1开放阅读框(a)及编码区氨基酸序列(b)Fig.2 Op
20、en reading frame(a)and coding amino acid sequences of RiPAL1(b)现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.9 91 图 3 RiPAL1 蛋白的功能结构域分析 Fig.3 Analysis of functional domain of RiPAL1 protein 图 4 RiPAL1 蛋白的信号肽预测 Fig.4 Prediction of signal peptides of RiPAL1 protein 图 5 RiPAL1 蛋白的跨膜结构域预测 Fig
21、.5 Prediction of potential transmembrane domains of RiPAL1 protein 图 6 RiPAL1 蛋白的亲疏水性预测 Fig.6 Prediction of hydrophobicity of RiPAL1 protein 2.2 RiPAL1 编码蛋白的理化性质分析 关键保守结构域是蛋白发挥催化功能的基础。对树莓 RiPAL1 编码蛋白的保守结构域分析表明,RiPAL1 蛋白包含 PLN02457 结构域,属于 Lyase_Like 超家族(图 3)。在 RiPAL1 蛋白的 192208 位氨基酸处是苯丙氨酸解氨酶典型的酶活性中心,
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