矢志方激活Sirt1-Foxo1通路调控内质网应激相关蛋白改善高尿酸血症小鼠肾损伤.pdf
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1、天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9矢志方激活Sirt1-Foxo1通路调控内质网应激相关蛋白改善高尿酸血症小鼠肾损伤*杨枫,王传旭,吴志远,张栩铭,高建东(上海中医药大学附属曙光医院,上海中医药大学中医肾病研究所,上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室,上海市中医临床重点实验室,上海201203)摘要:目的基于沉默信息调节因子1(Sirt1)-叉头转录因子1(Foxo1)通路观察矢志方对高尿酸血症(HUA)小鼠肾组织内质网应激(ERS)及下游分子增强子结合蛋白同源蛋白(Chop)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)12表达的影响,探讨其作用机制。
2、方法 32只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、非布司他组和矢志方组,每组8只。正常组给予生理盐水灌胃,其余各组予氧嗪酸钾250 mg/kg灌胃制备HUA小鼠模型。非布司他组和矢志方组分别按6 mg/kg、562.5 mg/kg灌胃相应药物,正常组和模型组予相同体积生理盐水灌胃,连续2周。体外实验培养人肾小管上皮细胞(HK2),分为正常组、模型组、矢志方组,饥饿24 h后予200 g/mL尿酸和300 g/mL矢志方干预24 h。苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察小鼠肾脏组织病理变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)和免疫组化染色检测小鼠肾组织Sirt1、
3、内质网跨膜蛋白肌醇酶1(IRE1)、Foxo1、Caspase 12、Chop表达,Western blot和免疫荧光染色检测HK2细胞Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达。结果 HE染色和Masson染色结果显示:与正常组比较,模型组小鼠肾小管管壁变薄,管腔扩张,炎性细胞浸润,大量蓝色胶原纤维沉积。与模型组比较,矢志方组小鼠肾小管管壁变薄、管腔扩张、蓝色胶原纤维集聚程度减少。Western blot结果显示:模型组较正常组相比肾组织和HK2细胞IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达显著升高(P0.01,P0.001),Sirt1蛋白表达显著降
4、低(P0.001),用药组较模型组相比肾组织和HK2细胞IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop蛋白表达显著降低(P0.05,P0.001),Sirt1蛋白表达显著升高(P0.001)。免疫组化染色和免疫荧光染色结果与Western blot结果一致。结论矢志方减轻肾脏病理损伤的机制可能与抑制HUA小鼠肾组织ERS、激活Sirt1-Foxo1通路表达有关。关键词:矢志方;高尿酸血症;Sirt1-Foxo1通路;内质网应激中图分类号:R285.5文献标志码:A文章编号:1672-1519(2023)09-1160-08DOI:10.11656/j.issn.1672-1519.202
5、3.09.13*基金项目:国家自然科学基金项目(81874437、82274415)。作者简介:杨枫(1995-),女,博士研究生在读,主要从事中医学防治慢性肾脏病研究。通讯作者:高建东,E-mail:。引用格式:杨枫,王传旭,吴志远,等.矢志方激活Sirt1-Foxo1通路调控内质网应激相关蛋白改善高尿酸血症小鼠肾损伤J.天津中医药,2023,40(9):1160-1167.实验研究 高尿酸血症(HUA)是由于嘌呤代谢紊乱导致血清尿酸(UA)升高的代谢综合征,对人体心脑血管、关节、肾脏等器官造成损害1-2。随着人们生活水平的提高,HUA的发病率逐年升高,UA长期堆积在肾脏会引起肾小管间质纤维
6、化,从而引发UA性肾病3。临床一线降UA药物如黄嘌呤氧化酶抑制剂非布司他、别嘌呤醇,促进UA排泄药物苯溴马隆等,长期服用存在一定副作用、血清UA控制不佳等问题4。沉默信息调节因子1(Sirt1)/叉头转录因子1(Foxo1)信号通路与肾脏病理生理发展密切相关。Sirt1在肾脏中广泛存在,激活Sirt1可抑制Foxo1乙酰化水平,对肾脏起保护作用。Sirt1表达增加可减轻草酸钙晶体诱导的肾损伤5,缓解脂多糖所导致的氧化应激引起的肾损伤6。内质网应激(ERS)是维持细胞内稳态的重要细胞器,肾小管上皮细胞损伤是一种病理和生理的改变,在HUA早期和进展期发挥关键作用7。在正常情况下,适度ERS能保护细
7、胞活性,如果长时间高UA刺激则会超出内质网代偿能力,造成细胞损伤8。矢志方是上海中医药大学附属曙光医院肾病科临床经验方。临床疗效较好,能显著降低痰浊瘀阻型HUA的UA水平9。前期大量基础实验研究表明,矢志方能降低HUA小鼠和HUA大鼠UA水平、改善HUA小鼠和HUA大鼠肾功能10-13。基于本课1160天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9题组前期研究基础,本实验通过建立HUA小鼠模型,观察基于Sirt1-Foxo1通路矢志方对HUA小鼠肾组织和高UA诱导HK2细胞ERS相关蛋白表达的影响,以期为矢志方的临床应用提供更多实验依据。1实验材料1.1动物选取32只8周龄
8、SPF级雄性BALB/c小鼠,体质量1222 g,购自上海斯莱克实验动物,动物许可证号SCXK(沪)2017-0005,伦理证号PZSHUTCM211227011。在上海中医药大学实验动物中心饲养,温度25 左右,湿度45%左右,12 h光照,普通饮食饮水喂养。1.2实验细胞人肾小管上皮细胞HK2,购自中国科学院细胞库。1.3实验药物动物用药:矢志方(车前子30 g,芥子15 g,王不留行15 g,冬葵子15 g),饮片购自上海中医药大学附属曙光医院,并委托国家中药制药工程技术研究中心制备成中药复方颗粒剂(1 g颗粒相当于原方20 g),用蒸馏水配制成70 mg/mL药液。非布司他片,40 m
9、g/片,江苏恒瑞医药股份有限公司,批号H20130081,用蒸馏水配制成0.75 mg/mL药液。矢志方冻干粉制作流程:称取炒王不留行、炒芥子各3.6 kg,炒车前子7.2 kg,冬葵子3.6 kg,混合均匀,打粉,粉碎后加入药材10倍体积纯净水包煎,先煮1 h,过滤,再加8倍水浸泡1 h,加热回流提取2次,每次1 h。最终得到冻干粉0.9 kg。细胞用药矢志方溶液配制:50 mL试管中加入10 mL含10胎牛血清(FBS)、1P/S的F12/DMEM完全培养基,称取矢志方干粉600 mg,加入到试管中,细胞裂解仪30功率5 min促进干粉溶解,矢志方溶液终浓度为60 mg/mL。UA配置:称
10、取100 mg UA加入10 mL双蒸水,震荡混匀充分溶解后滤过使用,UA溶液终浓度为10 mg/mL。1.4主要试剂与仪器氧嗪酸钾、羧甲基纤维素钠(CMCC-Na),上海麦克林生化科技有限公司,货号分别为P831461、C10097951;UA,美国Sigma公司,货号u2875-5 g;Sirt1,美国CST公司(货号8469s);内质网跨膜蛋白肌醇酶1(IRE1),美国CST公司(货号3294s)、武汉Abclonal公司(货号A17940);天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)12,美国Signalway Antibody公司(货号48277)、武汉Abclonal公司(货号
11、A22864);增强子结合蛋白同源蛋白(Chop),美国CST公司(货号2895s)、武汉Abclonal公司(货号A113466);Foxo1,美国CST公司(货号2880s);GAPDH,美国Proteintech公司(货号60004-I-Ig);-Tubulin,上海碧云天公司,货号AF2827;HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG,上海碧云天公司,货号分别为A0216、A0208;PVDF膜,美国Millipore公司,货号IPVH00005。离心机,美国Beckman公司,型号Avanti J-E;凝胶成像系统,上海天能生命科学有限公司,型号Tanon-5200;生物
12、组织冷冻包埋机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司,型号KD-BM;烘片机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司,型号KD-H;酶标仪,美国BioTek公司,型号Synergy 2;组织匀浆器,上海净信科技有限公司,型号JY-24;显微镜,日本奥林巴斯公司,型号CX33。2实验方法2.1动物分组、造模与给药造模及给药方法参考文献8,32只小鼠适应性饲养1周后,随机分为正常组、模型组、非布司他组和矢志方组,每组8只。正常组用同等体积生理盐水灌胃,其余各组采用250 mg/kg氧嗪酸钾溶液灌胃建立HUA小鼠模型。4 h后给予药物干预即非布司他组灌胃非布司他药液6 mg/kg,矢志方组灌胃矢志方药液562
13、.5 mg/kg,参考 中药药理实验方法学 的人与小鼠药物换算方式和本课题组前期实验,每只小鼠每10 g灌胃0.2 mL,每日1次,正常组和模型组予等体积生理盐水灌胃,造模与给药同时进行,连续2周。2.2细胞培养与造模方法将HK2细胞用含10FBS和1双抗的DMEM/F12培养基于5CO2、37 恒温培养箱中培养,细胞密度为90时进行细胞传代,取对数生长期细胞进行细胞铺板,细胞贴壁后用含0.5%FBS的DMEM/F12培养基饥饿处理12 h,再进行相应干预,干预24 h后处理细胞进行后续实验。将细胞分为正常组,模型组(200 g/mLUA),中药组(200 g/mL UA300 g/mL失志方
14、)。2.3取材第14日给药结束后,0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠,摘取双侧肾脏分别用于病理观察、蛋白免疫印迹法(Western blot)实验和免疫荧光染色。2.4病理观察小鼠肾脏组织经4%多聚甲醛组织固定液固定24 h,梯度脱水、浸蜡、包埋,4 m厚度切片,37 烤片12 h,然后进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色,中性树脂封片,显微镜下观察小1161天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9鼠肾脏组织病理形态。2.5Western blot检测取20 mg小鼠肾组织,加入RIPA裂解液200 L,匀浆机65 Hz匀浆1 min,4、12 000 rp
15、m离心15 min,离心半径6 cm。BCA法测定蛋白浓度,加入上样缓冲液和生理盐水配制成浓度为40 g/L的等量蛋白样品。上样,120 V电泳1 h,300 mA、1 h 30 min转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入IRE1一抗(11 000)、Sirt1一抗(11 000)、Foxo1一抗(11 000)、Caspase 12一抗(11 000)、Chop一抗(11 000)、-Tubulin一抗(11 000)、GAPDH一抗(15 000),4 孵育过夜;PBST洗膜3次,加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(11 000)、山羊抗兔IgG(11 000),室温孵育1
16、h;PBST洗膜3次,ECL化学发光法显影,凝胶成像系统拍摄。以GAPDH和-Tubulin为内参,计算目的蛋白相对表达量。2.6免疫荧光染色细胞经爬片、干预结束后,4%多聚甲醛室温固定爬片细胞30 min,室温通透细胞20 min,加入1%BSA室温封闭60 min,加入稀释的IRE1一抗(1200)、Sirt1一抗(11 000)、Foxo1一抗(11 000)、Caspase 12一抗(1400)、Chop一抗(1400),4 孵育过夜;加入荧光二抗(1500),避光孵育1 h,加入DAPI染细胞核5 min,甘油封片,荧光显微镜下观察。2.7免疫组化染色肾组织石蜡切片脱蜡至水,抗原修复
17、,3%牛血清白蛋白溶液(BSA)室温封闭30min,加入IRE1一抗(1100)、Sirt1一抗(1100)、Foxo1一抗(1100)、Caspase12一抗(1100)、Chop一抗(1100)。4 孵育过夜,加二抗室温孵育50 min,二氨基联苯胺(DAB)显色,中性树脂封片,光镜下观察,以棕黄色颗粒为阳性表达。3统计学方法采用SPSS22.0统计软件和Image J 1.8软件进行分析。实验数据以均数标准差(xs)表示,多重比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P0.05表示有统计学意义。4结果4.1矢志方对模型小鼠肾组织病理形态的影响与正常组比较,模型组小鼠肾组织结构
18、紊乱,肾小管管腔扩张、管壁变薄,肾间质炎性细胞浸润,大量蓝色胶原纤维沉积;与模型组比较,矢志方组和非布司他组小鼠肾小管管腔扩张、炎性细胞浸润、蓝色胶原纤维集聚程度减少。见图1。4.2矢志方对高UA小鼠肾组织和高UA诱导HK2细胞Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop蛋白表达的影响Western blot结果显示,与正常组比较,模型组小鼠肾组织IRE1、Foxo1、Caspase12、Chop蛋白表达显著升高(P0.01或P0.001),Sirt1蛋白表达显著降低(P0.001);与模型组比较,非布司他组小鼠肾组织和矢志方组小鼠肾组织IRE1、Foxo1、Caspase
19、 12、Chop蛋白表达显著降低(P0.001),Sirt1蛋白表达显著升高(P0.001)。细胞Western blot结果与HUA小鼠肾组织Western blot结果趋势一致,见图2,图3。4.3矢志方对高UA小鼠小鼠肾组织Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达的影响免疫组化染色结果显示,与正常组比较,模型组小鼠肾组织IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达显著升高(P0.01或P0.001),Sirt1表达显著降低(P0.001);与模型组比较,非布司他组和矢志方组小鼠肾组织IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达显著降低(
20、P0.05,P0.01或P0.001),Sirt1表达显著升高(P0.05)。见图4。4.4矢志方对高UA诱导HK2细胞Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase12、Chop表达的影响免疫荧光染色结果显示,与正常组比较,模型组细胞IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达显著升高,Sirt1表达显著降低;与模型组比较,矢志方组细胞IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop表达显著降低,Sirt1表达显著升高。见图5-9。5讨论HUA引起肾损伤的机制十分复杂,主要包括氧化应激、内皮功能障碍、肾纤维化和炎症3。本课题组前期研究发现矢志方临床疗效显著,前期基础实验研究
21、表明,矢志方能抑制白细胞介素-1(IL-1)IL-1表达、促进有机阴离子转运蛋白1/3(OAT1/3)、肝细胞核因子1/4(HNF1/4)表达减轻HUA小鼠肾脏损伤。ERS与肾损伤密切相关14-15,本研究中图 1各组小鼠肾组织形态(400)Fig.1Pathological changes of mouse kidney tissue ineach group(400)1162天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9注:A.正常组,B.模型组,C.矢志方组;与正常组比较,*P0.01,*P0.001;与模型组比较,#P0.05,#P0.001。图 2各组 HK2 细
22、胞 Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达情况(xs)Fig.2Protein expressions of Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop in HK2 cells of each group(xs)注:A.正常组,B.模型组,C.非布司他组,D.矢志方组;与正常组比较,*P0.01,*P0.001;与模型组比较,#P0.001。图 3各组小鼠肾组织 Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase 12、Chop 蛋白表达情况(xs)Fig.3Protein expressions of Sirt1、IRE1、Foxo1
23、、Caspase 12、Chop in mouse kidney tissue of each group(xs)发现ERS的调节因子Sirt1在HUA小鼠肾组织中显著下调,给予矢志方干预后能上调Sirt1表达水平、矢志方还能抑制ERS、改善肾损伤和间质纤维化。因此,Sirt1和ERS可能是HUA诱导的肾间质纤维化的潜在治疗靶点。内质网是一个表型和功能多样的传感平台,与调节蛋白沉积、脂质代谢、糖异生和钙信号传导等多种细胞功能密切相关,是维持和恢复代谢健康的重要组成部分。内质网稳态的紊乱通常被称为ERS,ERS是一种功能失衡状态,通过激活内质网激酶(PERK)/真核起始因子2(eIF2)途径中C
24、/EBP同源蛋白(Chop)、IRE1-凋亡信号调节激酶1(ASK1)-c-Jun N端激酶(JNK)通路、IRE1-X盒结合蛋白1(XBP1)-Chop通路、激活Caspase 12通路调控细胞凋亡。轻度ERS时,内质网可通过激活未折叠蛋白反应途径(UPR)启动自噬以恢复内质网稳态,促使细胞存活;当ERS刺激过强且持续存在时,会过度诱导自噬或激活凋亡途径使细胞死亡。UPR包括重建内质网稳态的途径以及触发凋亡的途径,即转录因子依赖和Caspase 12依赖的途SIRT1GAPDHIRE1Foxo1GAPDHCaspase12ChopGAPDH120 kd37 kd130 kd80 kd37 k
25、d50 kd25 kd37 kdSIRT1GAPDHIRE1Foxo1Caspase12ChopGAPDHGAPDH120 kd37 kd130 kd80 kd50 kd25 kd37 kd37 kd*#*#*#*#*#*#*#*#*#1163天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9注:A.正常组,B.模型组,C.非布司他组,D.矢志方组;与正常组比较,*P0.01,*P0.001;与模型组比较,#P0.05,#P0.01,#P0.001。图 4各组小鼠肾组织 Sirt1、IRE1、Foxo1、Caspase12、Chop 阳性表达情况(免疫组化染色,400)Fig.
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