七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用.pdf
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1、畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 8 4 8-3 8 6 2A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 2 4开放科学(资源服务)标识码(O S I D):七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用赵永攀1,2,郑芳芳2,尹俊卿2,杜 谦2,童德文2*,黄 勇2*(1.陕西省畜牧产业试验示范中心,泾阳 7 1 3 7 0 2;2.西北农林科技大学动物医学院
2、,杨陵 7 1 2 1 0 0)摘 要:随着集约化养殖业的发展,规模化养猪场对于病原的早期快速检测需求逐步增高,本研究旨在建立针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s,P R R S V)、猪瘟病毒(c l a s s i c a l s w i n e f e v e r v i r u s,C S F V)、猪圆环病毒2型(p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2,P C V
3、2)、猪流行性腹泻病毒(p o r c i n e e p i d e m i c d i a r-r h e a v i r u s,P E D V)、猪伪狂犬病病毒(p o r c i n e p s e u d o r a b i e s v i r u s,P R V)、猪传染性胃肠炎病毒(t r a n s m i s s i b l e g a s t r o-e n t e r i t i s v i r u s,T G E V)和猪细小病病毒(p o r c i n e p a r v o v i r u s,P P V)等7种常见病毒病病原感染的广谱磁纳米微粒可视化(u l
4、t r a s e n s i t i v e n a n o p a r t i c l e v i s u a l i z a t i o n d e t e c t i o n,UNV s)现场检测技术。根据不同病毒的复制酶区域的高度保守区域,设计探针和引物,通过探针的筛选和条件的优化,得到具有特异性强、富集效率和杂交效率高的目的病原基因序列特异性识别探针(富集探针和杂交探针),分别与四氧化三铁磁性微粒和纳米金偶联,制备成针对每种病原的特异性功能化磁珠和功能化纳米金。以功能化磁珠为载体富集核酸信号,功能化纳米金做桥梁放大信号,使用双探针同时检测病原核酸,结合碱性磷酸酶的酶促可视化反应检测
5、信号,建立针对猪P C V 2、P R V、P P V、P E D V、T G E V、P R R S V和C S F V等7种病毒的现场可视化UNV S便捷诊断技术。结果显示,筛选设计的核酸探针与猪的其它病原无交叉反应,特异性良好。建立的针对P C V 2、P R V、P P V、P E D V、T G E V、P R R S V和C S F V病原的UNV s可视化检测技术,检测限为1 03 c o p i e sm L-1(血清样本)或1 03 c o p i e sg-1(粪便样本),基本上达到了P C R或R T-P C R的检测敏感度,灵敏度组内与组间最大变异系数均小于5%,显色结
6、果稳定,无较大差异,有良好的重复性,单个样本的检测可在4 h以内完成。应用该技术和P C R检测对来自陕西省的4 9 9份临床样品(疑患有P C V 2、P R V、P P V、P E D V、T G E V、P R R S V和C S F V的猪的血清、粪便样品)进行同步检测和复检,结果显示,建立的针对7种病原的UNV s可视化检测方法不仅具有与普通P C R相同的敏感度,甚至与普通P C R相比有更高的检出率。本研究成功建立了针对P C V 2、P R V、P P V、P E D V、T G E V、P R R S V和C S F V病原的UNV s可视化检测技术,具有灵敏度较高、检测范围
7、广以及特异性和可靠性良好的优点,为猪的多种病原提供了一种快速、准确、灵敏的诊断技术。关键词:猪病毒病;磁纳米微粒;碱性磷酸酶;可视化;现场检测中图分类号:S 8 5 8.2 8 5.3 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 8 4 8-1 5收稿日期:2 0 2 2-1 2-2 8基金项目:国家自然科学基金(3 1 9 7 2 6 8 6;3 2 2 7 3 0 2 5);陕西省农业专项资金资助项目(X N D Y 2 2 0 9);陕西省创新能力支撑计划(2 0 2 3-C X-T D-6 0);陕西省重点研发计划(2 0 1 8 Z D C
8、X L-NY-0 2-0 7;2 0 2 0 NY-0 1 0);西安市科技计划项目(2 0 NYY F 0 0 3 2)作者简介:赵永攀(1 9 7 8-),男,陕西西安人,高级兽医师,主要从事动物疫病防控技术研究,E-m a i l:6 6 4 8 9 8 0 5q q.c o m*通信作者:黄 勇,主要从事动物感染性疾病的免疫病理与防控技术研究,E-m a i l:h u a n g y o n gn w s u a f.e d u.c n;童德文,主要从事动物感染性疾病的致病机制与防控技术研究,E-m a i l:d w t o n g n w s u a f.e d u.c nE s
9、 t a b l i s h m e n t a n d A p p l i c a t i o n o f M a g n e t i c N a n o p a r t i c l e V i s u a l i z a t i o n T e c h n i q u e f o r N u c l e i c A c i d D e t e c t i o n o f S e v e n C o mm o n S w i n e V i r u s e sZ HAO Y o n g p a n1,2,Z HE NG F a n g f a n g2,Y I N J u n q i n g
10、2,DU Q i a n2,TONG D e w e n2*,HUANG Y o n g2*(1.S h a a n x i A n i m a l H u s b a n d r y E x p e r i m e n t a l a n d D e m o n s t r a t i o n C e n t e r,J i n g y a n g 7 1 3 7 0 2,C h i n a;2.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,9期赵永攀等:七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用N o r t
11、h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g 7 1 2 1 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f i n t e n s i v e f a r m i n g,t h e d e m a n d f o r e a r l y a n d r a p i d d e t e c t i o n o f v a r i o u s p a t h o g e n s i n l a r g e-s c a l e p i g f a r
12、m s h a s g r a d u a l l y i n c r e a s e d.T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o e s t a b l i s h t h e b r o a d-s p e c t r u m m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e v i s u a l i z a t i o n d e t e c t i o n(UNV s)f i e l d d e t e c t i o n t e c h n o l o g y f o r p o r c i n e r
13、e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s(P R R S V),c l a s s i c a l s w i n e f e-v e r v i r u s(C S F V),p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2(P C V 2),p o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a v i r u s(P E D V),p o r c i n e p s e u d o r a b i e s
14、v i r u s(P R V),t r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s(T G E V),a n d p o r c i n e p a r-v o v i r u s(P P V).B a s e d o n t h e h i g h l y c o n s e r v e d r e g i o n s o f d i f f e r e n t v i r u s e s,p r o b e s a n d p r i m e r s w e r e d e s i g n e d,a n d
15、 s e q u e n c e-s p e c i f i c i d e n t i f i c a t i o n p r o b e s(e n r i c h m e n t p r o b e s a n d h y b r i d i z a t i o n p r o b e s)w i t h h i g h s p e c i f i c i t y a n d e n r i c h m e n t a n d h y b r i d i z a t i o n e f f i c i e n c y f o r t h e t a r g e t p a t h o g
16、 e n g e n e s w e r e o b t a i n e d t h r o u g h t h e s c r e e n i n g o f p r o b e s a n d o p t i m i z a t i o n o f c o n d i t i o n s,w h i c h w e r e c o u p l e d w i t h f e r r i c o x i d e m a g n e t i c p a r t i c l e s a n d n a n o g o l d,r e s p e c t i v e l y,t o p r e p
17、 a r e f u n c t i o n a l i z e d m a g n e t i c b e a d s s p e c i f i c f o r e a c h p a t h o g e n a n d f u n c t i o n a l i z e d n a n o g o l d.T h e f u n c t i o n a l i z e d m a g-n e t i c b e a d s w e r e u s e d a s c a r r i e r s t o e n r i c h n u c l e i c a c i d s i g n a
18、 l s,a n d f u n c t i o n a l i z e d n a n o g o l d w a s u s e d a s a b r i d g e t o a m p l i f y s i g n a l s,a n d t h e d u a l p r o b e s w e r e u s e d t o s i m u l t a n e o u s l y d e t e c t p a t h o-g e n i c n u c l e i c a c i d s,c o m b i n e d w i t h t h e e n z y m a t i
19、 c v i s u a l i z a t i o n r e a c t i o n o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t o d e t e c t s i g n a l s,t o e s t a b l i s h a c o n v e n i e n t d i a g n o s t i c t e c h n i q u e f o r o n-s i t e v i s u a l i z a t i o n o f UNV S f o r s e v e n k i n d s o f v i r u s e s,i n
20、 c l u d i n g P C V 2,P R V,P P V,P E D V,T G E V,P R R S V,a n d C S F V.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e n u c l e i c a c i d p r o b e s d e s i g n e d f o r s c r e e n i n g d i d n o t c r o s s-r e a c t w i t h o t h e r p a t h o g e n s o f p i g s a n d h a d g o o d s p e
21、 c i f i c i t y.T h e e s t a b l i s h e d t e c h n i q u e f o r t h e v i s u a l i z a t i o n o f UN-V s f o r P C V 2,P R V,P P V,P E D V,T G E V,P R R S V a n d C S F V p a t h o g e n s h a s a d e t e c t i o n l i m i t o f 1 03 c o p i e sm L-1 s e r u m s a m p l e o r 1 03 c o p i e s
22、g-1 s t o o l s a m p l e,w h i c h b a s i c a l l y a c h i e v e s t h e s e n s i-t i v i t y o f P C R o r R T-P C R d e t e c t i o n,t h e m a x i m u m c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n w i t h i n a n d b e t w e e n g r o u p s i s l e s s t h a n 5%,t h e c o l o r i m e t r i c
23、 r e s u l t s a r e s t a b l e w i t h o u t l a r g e d i f f e r e n c e s,t h e r e i s g o o d r e p r o d u c i b i l i t y,a n d t h e d e t e c t i o n o f a s i n g l e s a m p l e c a n b e c o m p l e t e d i n l e s s t h a n 4 h.T h e r e-s u l t s o f s i m u l t a n e o u s t e s t i
24、 n g a n d r e t e s t i n g o f 4 9 9 c l i n i c a l s a m p l e s(s e r u m a n d f e c a l s a m p l e s f r o m p i g s s u s p e c t e d o f h a v i n g P C V 2,P R V,P P V,P E D V,T G E V,P R R S V a n d C S F V)f r o m S h a a n x i P r o v i n c e b y a p p l y i n g t h e t e c h n i q u e
25、 a n d P C R a s s a y s h o w e d t h a t t h e e s t a b l i s h e d v i s u a l i z a t i o n m e t h-o d f o r UNV s a g a i n s t s e v e n p a t h o g e n s n o t o n l y h a d t h e s a m e s e n s i t i v i t y a s o r d i n a r y P C R,b u t e v e n h a d a h i g h e r d e t e c t i o n r a
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