浓香型白酒酿造过程中酒醅微生物区系变化特征分析.pdf
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1、DOI:10.13746/j.njkj.2022273作者简介:陈进。浓香型白酒酿造过程中酒醅微生物区系变化特征分析陈进1,3,陈萍2,谭光迅2,杨博2,龚大春1,3,4(1.湖北省生物酵素工程技术研究中心(三峡大学),湖北 宜昌 430072;2.湖北稻花香酒业股份有限公司,湖北 宜昌 443112;3.三峡大学生物与制药学院,湖北 宜昌 443002;4.中国轻工业功能酵母重点实验室(三峡大学),湖北 宜昌 430072)摘要:采用高通量测序技术研究浓香型白酒发酵过程中窖池内不同深度糟醅的细菌群落组成,探讨理化因子的变化规律及与细菌群落结构变化的相关性,为提高浓香型白酒的品质提供生物学理论
2、依据。结果表明,不同深度糟醅的群落结构无明显差异,不同发酵阶段糟醅的微生物菌群差异相对较大。入窖时乳酸杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)是主要的优势菌属,发酵前期醋酸菌(Acetobacter)是主要的菌属(52.74%),乳酸杆菌属(Lactobacillus)在中后期占绝对优势,最高相对丰度达96.42%。冗余分析(RDA)表明,还原糖、乙醇、含水量、乳酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯是与菌群相关性较高的理化因子。上述研究揭示了浓香型白酒发酵过程中微生物区系的特征和变化规律,
3、以及与理化性质的相关性,可为科学认识浓香型白酒发酵过程与机制提供理论依据。关键词:浓香型白酒;酒醅;微生物菌群;动态演变中图分类号:TS262.3;TS261.1文献标识码:A文章编号:1001-9286(2023)08-0017-07Changes of Microbial Flora in Fermented Grainsof Nongxiang Baijiu during FermentationCHEN Jin1,3,CHEN Ping2,TAN Guangxun2,YANG Bo2and GONG Dachun1,3,4(1.Hubei Research Center of Bioe
4、nzyme Engineering Technology,China Three Gorges University,Yichang,Hubei 430072;2.Daohuaxiang Distillery Co.Ltd.,Yichang,Hubei 443112;3.College of Biological and Pharmaceutical Sciences,China Three Gorges University,Yichang,Hubei 443002;4.Key Laboratory of Functional Yeastof China Light Industry,Chi
5、na Three Gorges University,Yichang,Hubei 430072,China)Abstract:High-throughput sequencing technology was used to study the bacterial community in the fermented grains of NongxiangBaijiu at different depths in the pit during fermentation,and the changes of physicochemical factors in the pit and their
6、 correlationwith the changes of bacterial community structure were explored.The results showed that there was no significant difference in bacte-rial community structure at different depths,while there was obvious difference in the microbial flora in the fermented grains at differ-ent fermentation s
7、tages.Lactobacillus,Pseudomonas,Bacillus and Staphylococcus were the dominant bacteria when the fermentedgrains were put into the pit.Acetobacter was dominant(52.74%)at the early fermentation stage,while Lactobacillus was dominant(96.42%)at the middle and late fermentation stages.Redundancy analysis
8、(RDA)showed that reducing sugar,ethanol,water content,lactic acid,ethyl lactate,ethyl acetate and ethyl butyrate were the physicochemical factors with high correlation with bacterial commu-nity.The study has revealed the characteristics and change rules of microbial flora in the fermented grains of
9、Nongxiang Baijiu duringfermentation,as well as their correlation with the physicochemical properties,thus providing theoretical basis for scientific under-standing of the fermentation process and mechanism of Nongxiang Baijiu.Key words:Nongxiang Baijiu;fermented grains;microbial flora;dynamic evolut
10、ion酿酒科技2023年第8期(总第350期)LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.8(Tol.350)1717酿酒科技2023年第8期(总第350期)LIQUOR-MAKING SCIENCE&TECHNOLOGY2023 No.8(Tol.350)中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一,广受世界人民的喜爱。根据主体香型的不同,中国白酒大体上可分为三大类:浓香型、酱香型和清香型。浓香型白酒以其“窖香浓郁、绵甜爽净、香味协调、余味悠长”的特点深受消费者喜爱1。浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础,发酵过程是栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物区系在糟醅固、液、气三相
11、界面的复杂的物质能量代谢过程2,以富含淀粉的粮谷类为原料,以酒曲为糖化剂,采用续糟拌和、混蒸混烧、凉醅下曲、分层分批入窖、固态发酵、蒸馏出酒、精心勾兑等工艺进行生产3。浓香型白酒的酿造过程是传统的封闭式固态发酵,复杂的微生物群落除了受到环境微生物、原料、环境温度、环境湿度等外源因素的影响,还受到群落自身演替、代谢产物变化、生物热变化、含水量变化等内源发酵条件的影响。目前国内主要对浓香型白酒的酒曲、窖泥以及短期发酵过程的微生物菌群进行了跟踪研究,对于长期的窖池发酵以及空间上菌群的结构差异研究不足。对发酵过程中窖池内微生物区系变化特征的研究就是对在窖池环境下微生物生态学的研究。微生物生态学的研究内
12、容包括确定微生物的数量、群体结构和活性,对于保护和改善生态环境、构建人工生态系统、提高废水生物处理的效率有着重要的科学意义和实用价值4。传统的微生物鉴定方法操作简单,可以直接获取目标微生物,一直沿用至今。自然界中超过 99%的微生物都是不可直接培养的,绝大多数微生物不能通过纯培养的方式获得。传统分离培养的方法工作量大,不能完整反映微生物复杂的群落组成5。施安辉6采用稀释平板涂布的方法,发现了酒醅中的细菌、酵母菌和霉菌的数量变化特征;吴衍庸等7考查了窖池中不同位置窖泥中六大类厌氧菌(甲烷菌、梭状芽孢杆菌属、乳酸菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌及厌氧异氧菌)的差异性;岳元媛等8采用厌氧培养方法对窖泥
13、中的细菌进行筛选分离,共筛选到8个属的细菌,绝大多数为兼性厌氧细菌,梭菌属细菌仅占1%左右,这与采用未培养技术得到的结果大相径庭,采用传统培养技术对环境微生态的研究不足以全面准确的发现微生物的菌群结构和演替特征。随着科学的进步,分子生物学手段逐渐进入了生态学研究的视野并成为生态学研究的重要技术,“高通量测序技术(High-Throughput Sequencing)”以其测序量大、灵敏、高速、高信息量、低成本等特点成为微生态学研究中应用的热门技术9。高通量测序技术是对第一代测序技术的一次技术革新,可以同时对千万条DNA序列进行测序,所以高通量测序技术也被称为“第二代测序技术”“下一代测序技术(
14、Next Generation Sequencing,NGS)”和“深度测序”10。高通量测序为研究人员和科学家提供了一种革命性的工具,可以快速、经济地获取 DNA 序列。与传统的Sanger测序相比,使用高通量测序获得的每单位DNA序列(即碱基对)显著更具成本和时间效益。雷振河11应用高通量测序技术对清香型白酒酿造用大曲和酒醅中微生物构成进行了分析,发现大曲中优势真核微生物主要包括曲霉菌属、热子囊菌属、根霉菌属、嗜热真菌属、假丝酵母,醋酸杆菌科和乳杆菌科是清香型发酵酒醅中优势原核微生物,占原核微生物70%以上;邓杰等12利用高通量测序技术研究浓香型白酒窖池窖泥微生物群落结构,发现Clostr
15、idiales Family XI.IncertaeSedis随着窖龄的增加呈现减少的趋势,Actinobac-teria类群和Synergistetes类群随着窖龄的增加呈现增加的趋势,Haloplasmataceae类群和Clostridiaceae类群只在30年窖龄的窖池中有检测出,Lactobacil-laceae类群和Porphyromonadaceae类群只在30年窖龄的一口窖池中是优势细菌类群;李欣等13通过高通量测序技术对酱香型白酒福矛窖酒发酵的不同时期酒醅微生物进行多样性分析,发现堆积发酵酒醅的优势微生物为乳球菌属、醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、梭形杆菌属、假丝酵母属、曲霉属,窖内
16、发酵酒醅的优势微生物为乳杆菌属、醋酸杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、曲霉属、嗜热子囊菌属、假丝酵母属;李斌等14基于 Illumina Miseq 测序方法研究了浓香型白酒中高温酒曲和芝麻香型白酒高温酒曲的微生物菌群结构,结果表明浓香型白酒中高温酒曲的优势类群主要有9个属,包括乳杆菌属(Lac-tobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella)和片球菌属1818(Pediococcus)等,芝麻香型白酒高温酒曲的优势类群主要有芽孢杆菌属(Bacillus)和别样芽孢杆菌属(Allobacillus);栗连会等15利用16S rRNA基因高通量测序技术比较了大曲、酒醅和窖泥中的乳酸菌群落结构
17、,并解析了酒醅乳酸菌在发酵过程中的动态变化,结果表明,发酵过程酒醅中存在 49 种乳酸菌,其中16种来源于大曲,3种来源于窖泥,酒醅乳酸菌群落结构在发酵的第一周出现剧烈变动,发酵2 d后Lactobacillus acetotolerans取代Weissella con-fusa成为优势微生物并保持至发酵结束。本研究拟利用高通量测序技术,探究发酵过程中微生物结构以及主要的功能微生物,结合环境因子,分析其对浓香型白酒发酵过程微生态结构的影响。了解浓香型白酒酿造过程中微生物资源状况,进一步认识其生态功能,加强对窖池微生物资源的利用。有利于改善白酒的生产工艺,为进一步提高浓香型白酒的品质、人工改造窖
18、池微生物菌群等提供生物学依据。1材料与方法1.1材料、试剂样品:取样于湖北某酒厂生产一车间中的某一窖池,选取发酵1 d、3 d、9 d、15 d、30 d、70 d、90 d为发酵节点,采用四点取样法对窖池四个角共取30 g左右样品混合,分别取窖池每个节点的上层(距离窖顶40 cm)、中层(距离窖顶1 m)、底层(距离窖底40 cm)三层糟醅的样品,共计21个样本(样本编号见表1)。混合均匀后分成两份样品,一份-20 保存并及时进行酒醅微生物基因组DNA提取,另一份进行理化性质和有机酸含量检测。试剂及耗材:葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、重蒸苯酚、亚硫酸钠、四氢呋喃、乙酸乙
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