宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析.pdf
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1、 Chinese Journal of Wildlife 2023,44(3):556-564Chinese Journal of Wildlifehttp:/宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析阚龙飞1,2,孟宪踊1,2,闫飞虎2,李元果2,王铁成2,徐钰3,初冬3,王卫东4,李岳城4,赵永坤2,高玉伟1,2,冯娜1,2*,夏咸柱1,2*(1.吉林农业大学动物医学院,长春,130118;2.中国农业科学院长春兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,长春,130122;3.国家林业和草原局生物灾害防控中心,沈阳,110034;4.宁夏回族自治区森林病虫防治检疫总站,银川,7
2、50001)摘 要为探究宁夏野生岩羊(Pseudois nayaur)小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的分子遗传特征,根据GenBank公布的PPRV基因组序列设计并合成13对全基因组扩增引物,通过RT-PCR和DNA测序及拼接获取毒株(wild-bharal/China-NXYH/2021株)全基因组序列,借助DNASTAR和MEGA 7.0软件进行序列分析。结果显示:该毒株属于基因系,基因组全长为 15 954 nt;在系统进化上,与2013年以来中国流行株和20162017年蒙古流行株亲缘关系较近,共同组成一个小的进化分支;在全
3、基因组一致性分析中,与国内新疆流行株goat/China-XJYL/2013一致性最高(99.4%),与国内其他野生动物PPRV株wild-bharal/China-Tibet/2008、Ibex/China-XJBZ/2015 和 Procapra-przewalskii/China-GS/2018 的 一 致 性 分 别 为 96.8%、98.8%和99.0%。在H和F蛋白氨基酸多态性分析中,发现该毒株H和F蛋白中均出现了独特的氨基酸突变,分别为 H 蛋白的 R285Q、S421R 和 F 蛋白的 R/K/T3W、Q305R。结果表明,小反刍兽疫病毒已传入宁夏野生动物种群,为我国小反刍兽疫
4、根除工作带来新的困难和挑战,需加强对宁夏野生动物PPRV感染情况的追踪和监测,以便及时从传染源和传播途径方面阻断PPRV的传播。稿件运行过程收稿日期:2022-12-07修回日期:2022-12-20关键词:小反刍兽疫病毒;野生岩羊;宁夏;全基因组测定;系统进化分析Key words:PPRV;Wild bharal(Pseudois nayaur);Ningxia;Whole genome sequencing;Phylogenetic analysis中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:2310-1490(2023)-03-0556-09DOI:10.12375/ysdwxb
5、.20230310基金项目:国家林业和草原局疫源疫病监测项目(2020076007)第一作者简介:阚龙飞,男,26岁,硕士研究生;主要从事分子病毒学研究。E-mail:*通信作者:冯娜,E-mail:;夏咸柱,E-mail:阚龙飞等:宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析第3期Whole Genome Determination and Phylogenetic Analysis of PPRV Isolated from Wild Bharal in NingxiaKAN Longfei1,2,MENG Xianyong1,2,YAN Feihu2,LI Yuanguo2,WANG
6、Tiecheng2,XU Yu3,CHU Dong3,WANG Weidong4,LI Yuecheng4,ZHAO Yongkun2,GAO Yuwei1,2,FENG Na1,2*,XIA Xianzhu1,2*(1.College of Animal Medicine,Jilin Agricultural University,Changchun,130118,China;2.Changchun Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agriculture Sciences,Key Laboratory of Zoonosis
7、Prevention and Control of Jilin Province,Changchun,130122,China;3.Biological Disaster Prevention and Control Center of the National Forestry and Grassland Administration,Shenyang,110034,China;4.Ningxia Hui Autonomous Region Forest Disease and Insect Control and Quarantine Station,Yinchuan,750001,Chi
8、na)Abstract:In order to explore the molecular genetic characteristics of peste des petits ruminants virus(PPRV)isolated from wild bharal(Pseudois nayaur)in Ningxia,13 pairs of whole genome amplification primers were designed and synthesized according to the PPRV genome sequence published on GenBank.
9、The whole genome sequence of the virus strain(wild-bharal/China-NXYH/2021 strain)was obtained through RT-PCR,DNA sequencing and splicing,and its sequence was analyzed with DNASTAR and MEGA 7.0 software.The results showed that the strain belonged to gene IV strain,with a total genome length of 15,954
10、 nt.In terms of phylogenetic evolution,it was close to the Chinese epidemic strains since 2013 and the Mongolian epidemic strains from 2016 to 2017,forming a small evolutionary branch.In the genome wide identity analysis,the highest identity(99.4%)was found with the domestic Xinjiang epidemic strain
11、 goat/China-XJYL/2013,and 96.8%,98.8%and 99.0%with other domestic wild animal PPRV strains wild-bharal/China-Tibet/2008,Ibex/China-XJBZ/2015 and Procapra-przewalskii/China-GS/2018,respectively.In the analysis of amino acid polymorphism of H and F proteins,unique amino acid mutations were found in bo
12、th H and F proteins of the strain,namely R285Q and S421R of H protein and R/K/T3W and Q305R of F protein.The results showed that the peste des petits ruminants virus had been introduced into the wildlife population of Ningxia,bringing new difficulties and challenges to the eradication of peste des p
13、etits ruminants in China.The results suggest that it is necessary to strengthen the tracking and monitoring of PPRV infection of wild animals in Ningxia,so as to timely block the transmission of PPRV from the source of infection and transmission routes.小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科(Pa
14、ramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、高度传染性和致死性疾病1;天然宿主为山羊和绵羊,此外还可能感染多种野生动物;临床症状包括发热、眼鼻有脓性黏液分泌物、坏死性和糜烂性口腔炎、胃肠炎、腹泻和支气管肺炎2。PPRV为单股负链RNA病毒,只有1个血清型;基因组包含6个基因,依次为3-N-P-M-F-H-L-5,对应编码6种结构蛋白,分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大蛋白(L),此外P基因还编码2种非结构蛋
15、白 C、V3。根据 N 或 F 基因序列系统进化分析,PPRV可分为4个谱系(),其中、系主要流行于非洲,系主要流行于亚洲,我国流行的也是谱系34。2007 年 7 月,我国西藏阿里地区首次报道了PPR疫情,同年在西藏革吉、日土、札达和改则4县也出现了该疫情,并于2008年6月和2010年5月在西藏尼玛县和日土县两度暴发5。2013年11月,新557野 生 动 物 学 报第44卷疆伊犁出现PPR疫情,同年在新疆阿克苏、哈密和巴音郭楞相继出现PPR疫情,并在2014年上半年迅速蔓延至中国大部分地区,包括甘肃、内蒙古和宁夏等22个省、直辖市和自治区6。随着小反刍兽疫强制免疫计划在全国的大范围实施,
16、近年来我国家羊的PPR呈现零星散发状态。PPRV除了在家畜中流行以外,在野生动物中也多次被发现,如 20072008年,西藏日土县和革吉县两地相继报道了野生岩羊(Pseudois nayaur)感染PPRV病例7;20132016年,新疆鄯善、博乐、乌鲁木齐、巴里坤和库车的野生北山羊(Capra ibex sibirica)、盘羊(Ovis ammon)和鹅喉羚(Gazella subgutturosa)种群中也曾出现过感染PPRV病例8;20172018年,青海海北州刚察县、新疆阿克苏地区和甘肃省西部分别发现少量野生岩羊、野生北山羊和普氏原羚(Procapra przewalskii)死于P
17、PRV感染911;2021年12月,青海省都兰县和西藏拉萨市两地分别发现 34只和 58只野生岩羊死于 PPRV感染12。这些野生动物中PPRV的持续存在,不但威胁着包括濒危物种在内的多种野生动物生命安全,还会阻碍PPR全球根除计划的完成。因此,除了要严格执行国家制定的小反刍兽疫强制免疫计划外,还应该继续监测野生动物中PPRV的感染情况,以便及时采取有效的防控措施。本研究对 wild-bharal/China-NXYH/2021 株进行了全基因组测定和系统进化分析,旨在明确其所属的基因谱系以及与国内外 PPRV 流行株的亲缘关系。研究结果可以为野生动物PPR流行病学特点和PPRV分子生物学特征
18、提供参考依据。1材料与方法1.1病料样品2021年1月,宁夏岩画发现1只疑似被PPRV感染的野生岩羊,该岩羊的脾、肺组织样品被置于干冰泡沫箱内运送至中国农业科学院长春兽医研究所。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据 GenBank 公布的 PPRV 基因组序列,设计13对全基因组扩增引物(表1),由吉林省库美生物科技有限公司合成。表113对PPRV全基因组扩增引物Tab.1 13 pairs of whole genome amplification primers for PPRV序号Order number12345678910111213引物序列(53)Primer sequence(
19、53)1F:ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAG1R:TGACAAGCCTGTCGAGCAGTC2F:TCCCGATTCCCGGAGACTC2R:TGATGGTCTGGAGTGCTTGAC3F:TGACGACAGCGATGTGGACTC3R:TGGCAGTTGACCTACCAACCC4F:CATCCGCTCCATAATCAAGTC4R:GACAGCTTGGATTTTGACTATTC5F:CAGTCAACCTAGTCCCGCTT5R:GATGATGAGTAGGGTGTGCT6F:CCCTCCAAACCAAAGGAATCACC6R:CAGTGAATCTGACACGCAACAACAT7
20、F:CCATGCGCAAACATCATGAC7R:TCTATCAGGGTTGAGGAATTTAATC8F:TGCTTGGAGTCCTGCTGGTAA8R:GATGAGCGACTCGTGTCATAG9F:TGGTCATATTGCCGACGATGG9R:ATGAAAAAATCTCCCCAGTTAGATG10F:TCGTTGGCTTATCTTCAACTTCAGG10R:GTTGTTGATCCGACATAAGGTACAC11F:AAACGGGCTCAAGTCACTACG11R:GGTTGTTTAAAGTCGACGTCTG12F:ACCATATACTGGCTAAGTCTACA12R:TCGAGAGTGA
21、ACAACCATTCT13F:AGACGGCCTTATGAGCTCTAC13R:ACCAGACAAAGCTGGGAATAG退火温度/Annealing temperature56576053545953565457555355产物长度/bpProduct length2762 2621 4441 1671 0178292 2021 5341 4762 7921 5672 194503558阚龙飞等:宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析第3期1.2.2病毒RNA提取和RT-PCR将组织样品研磨后,4、9 000 g,离心5 min,吸取适量上清按病毒RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京
22、)有限公司)说明书提取总RNA。配制50 L反转录体系:28 L RNA,10 L AMV Buffer(5),4 L AMV反转录酶,5 L dNTP(10 mmol/mL),1 L Random primer(N9),1 L Oligo(dT)primer,1 L RRI(反转录所用试剂均购自TaKaRa公司)。反应条件:30 反应10 min,使Random primer(N9)达到足够长度;42 反转录1 h;95 反应5 min,灭活AMV反转录酶。使用13对PPRV全基因组扩增引物分别对反转 录 产 物 进 行 PCR,50 L PCR 体 系 包 含 4 L cDNA,25 L
23、高 保 真 酶 2Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司),上、下游引物各 2 L,17 L RNase Free ddH2O。反应程序:95 预变性3 min;35个循环(95 变性15 s;退火温度见表1,退火15 s;72 延伸时间=1 min/kb(表 1 中对应片段长度/1 000)kb=0.53.0 min);72 终延伸5 min。1.2.3全基因组序列测定和拼接PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,按照Eastep凝胶及PCR回收试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)说明书进行胶回收,回收产物送至吉林省库美生物科技有限公司测序
24、,参考 GenBank 公布的PPRV基因组序列,使用DNASTAR Lasergene v7.1.0的SeqMan Pro软件拼接测序结果,最后获得该PPRV株全基因组序列,并将其命名为 wild-bharal/China-NXYH/2021株。1.2.4系统进化分析和序列一致性分析从 GenBank 分别下载不同基因型、宿主、国家(地区)和时间的PPRV参考株N基因和全基因组序列,随后将序列导入 MEGA 7.0 软件中,各毒株按“宿主/国家(地区)/时间”格式命名(表 2),使用ClustalW方法进行多序列比对;通过maximum likelihood法建立系统进化树,Bootstra
25、p method设为1 000次重复,Model/Method设为Kimura 2-parameter model。打 开 DNASTAR Lasergene v7.1.0 的 MegAlign软 件,使 用 ClustalW 方 法 比 对 wild-bharal/China-NXYH/2021株和PPRV参考株的核苷酸序列或氨基酸序列,比对结束后点击View菜单栏下的Sequence Distances。2结果2.1PCR扩增结果提取的总RNA经过RT-PCR、1%琼脂糖凝胶电泳(图1)和胶回收后,获得了13个大小符合预期的基因片段。2.2wild-bharal/China-NXYH/20
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