尿石素A抑制BMMs向破骨细胞分化.pdf
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1、作者单位:200011上海市骨科内植物重点实验室、上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科通信作者:谢幼专,电子信箱:drxie_miss 尿石素 A 抑制 BMMs 向破骨细胞分化周贤豪谢幼专摘要目的探究尿石素 A 对小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMMs)向破骨细胞分化的影响。方法提取小鼠骨髓腔 BMMs,通过 CCK-8 法检测尿石素 A 对 BMMs 的增殖毒性,使用核因子-B 受体活化因子配体(recep-tor activator of nuclear factor-B ligand,RANKL)诱导 BMMs 向破骨细胞分化并
2、与浓度梯度尿石素 A 共培养,抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色检测破骨细胞数量和面积大小,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantita-tive polymerase chain reaction,RT-qPCR)法检测破骨分化相关基因水平表达,2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-Dichlo-rofluorescin diacetate,DCFH-DA)检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果CCK-8 法检测结果显示,尿石素A 在 16mol/L 范围内
3、对 BMMs 无明显毒性;TRAP 染色结果表明,尿石素 A 显著抑制了 BMMs 向破骨细胞分化,成熟破骨细胞数目和面积减少(P 0.01);RT-qPCR 检测结果显示,尿石素 A 明显抑制了破骨分化相关基因(C-FOS、CTSK、MMP9、ACP5)的相对表达水平(P 0.01);DCFH-DA 检测结果显示,尿石素 A 明显降低了 RANKL 诱导的高 ROS 水平。结论尿石素 A 能抑制 RANKL 诱导的 BMMs 向破骨细胞分化,并降低分化过程中的 ROS,有望作为骨质疏松治疗的潜在药物。关键词尿石素 A破骨分化活性氧中图分类号R68文献标识码ADOI 10.11969/j.is
4、sn.1673-548X.2023.07.020Urolithin A Inhibits the Differentiation of BMMs into Osteoclast.ZHOU Xianhao,XIE Youzhuan.Shanghai Key Laboratory of Orthope-dic Implants,Department of Orthopedic Surgery,Shanghai Ninth Peoples Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200011,ChinaAb
5、stractObjectiveTo investigate the effect of urolithin A on differentiation of mice bone marrow derived macrophages(BMMs)into osteoclast.MethodsThe BMMs were extracted from the bone marrow cavity of mice.The proliferation toxicity of urolithin A toBMMs was detected by CCK-8 method.Receptor activator
6、of nuclear factor-B ligand(RANKL)induced osteoclast differentiation ofBMMs and co-cultured with concentration gradient urolithin A.Tartrate resistant acid phosphatase(TRAP)staining to detect the numberand area size of mature osteoclasts.The expression of osteoclast differentiation-related genes was
7、detected by real-time quantitative pol-ymerase chain reaction(RT-qPCR).2,7-Dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)was used to detect the cellular ROS levels.ResultsCCK-8 test results showed that no obvious toxicity of urolithin A to BMMs in the range of 16mol/L.The TRAP staining re-sults showed that u
8、rolithin A significantly inhibited the differentiation of BMMs into osteoclast,and the number and area of mature osteo-clasts decreased(P 0.01).RT-qPCR test results showed that urolithin A significantly inhibited the relative expression of osteoclastdifferentiation-related genes(C-FOS,CTSK,MMP9,ACP5
9、)(P 0.01).DCFH-DA fluorescence assay test showed that urolithinA significantly decreased RANKL-induced high ROS.ConclusionUrolithin A can inhibit RANKL-induced differentiation of BMMsinto osteoclast and decrease the ROS during differentiation,which may be a potential drug for osteoporosis treatment.
10、Key wordsUrolithin A;Osteoclast differentiation;Reactive oxygen species骨质疏松症是一种以骨矿物质密度降低和骨微结构退化为特征的骨病,导致骨脆性和骨折风险提高,由骨吸收和骨形成不平衡导致1。原发性骨质疏松症主要见于绝经后女性,约占 2/3,因卵巢功能退化,雌激素分泌减少引起;65 岁以上人群,由衰老相关引起2。在未来 20 年里,随着人口老龄化,世界上 65 岁以上的人口将超过 4.5 亿,骨质疏松症特别是绝经后骨质疏松症的患病率将进一步扩大,其社会经济影响已引起广泛关注3。雌激素缺乏性骨质疏松以高骨量转化为特点,破骨活性显
11、著增加,成骨活性减弱,骨吸收超过骨形成,导致净骨丢失4。目前临床上用于治疗骨质疏松的常用药物,如双膦酸盐只能单纯抑制破骨吸收,无法促进成骨,而特立帕肽主要用于促进成骨活性,无破骨抑制功能,且长期使用79医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著这些 药 物 不 良 反 应 较 大,如 高 钙 血 症、恶 性 肿 瘤等5。因此寻找既能促进成骨,又能抑制破骨的安全有效药物是目前抗骨质疏松治疗的研究重点。尿石素 A 是一种天然化合物,由肠道菌群通过代谢鞣花单宁和鞣花酸产生,鞣花酸是石榴、浆果和坚果等 食 物 中 富 含 的 复 合 多 酚 且 生 物 利 用 度 很低6。尿石素 A
12、 作为一种具有有益作用的强效药剂而备受关注。既往研究发现,尿石素 A 具有减轻结肠炎、心肌损伤、神经保护等抗炎、抗氧化、抗凋亡作用7 9。近年来研究表明,尿石素 A 能增强骨髓来源间充质干细胞成骨分化,促进骨缺损修复10。越来越多的证据也表明,肠道菌群的代谢调节与骨稳态密切相关11。然而目前缺乏尿石素 A 对于破骨细胞的研究。因此,本研究拟探讨尿石素 A 对骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMMs)体外破骨细胞分化的影响。材料与方法1.实验材料:尿石素 A 购自美国 Selleck 公司;胎牛血清购自澳大利亚 VWR 公司;-MEM 培养基和胰
13、酶购自美国 Gibco 公司;巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子-B 受体活化 因子配体(RANKL)购自美 国R&D 公司;CCK-8 试剂盒和 2 SYBR Green qPCRMaster Mix(Low ROX)购自美国 Bimake 公司;TRAP染色试剂盒购自美国 Sigma-Aldrich 公司;4%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)购自武汉赛维尔生物科技有限公司、胰蛋白酶购自苏州新赛美生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT MasterMix
14、 购自日本 TaKaRa 公司;活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。2.BMMs 细胞提取:4 6 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司生产许可证号:SCXK(沪)2013-0016;使用许可证号:SYXK(沪)2018-0026。麻醉处死小鼠后浸泡于75%乙醇中消毒 15min。在超净工作台中剔除软组织分离得到股骨和胫骨,减去骨组织两端暴露骨髓腔,1ml 注射器吸取含 30ng/ml M-CSF 的完全培养基反复冲洗骨髓腔至发白,收集于 10cm 培
15、养皿中,37、5%CO2细胞培养箱中培养。3 天全换液,弃去未贴壁细胞和残留组织,即为原代 BMMs 细胞。之后2 天换液 1 次,待细胞长至 80%90%左右时,胰酶消化并重悬用于后续实验。3.CCK-8 法检测细胞增殖毒性:将 BMMs 以8 103个/孔的密度种于 96 孔板中,待细胞贴壁后,加入含 M-CSF(30ng/ml)和浓度梯度的尿石素 A(0、4、8、16、32、64mol/L)培养基,分别在培养 48、96h 后。每孔替换成含 10l CCK-8 试剂的 110l培养基,培养箱避光孵育 2h 后,使用酶标仪 450nm波长下测定吸光度 A 值,650nm 为参照。计算相对增
16、殖率,将 48h 的对照组细胞设为 100%。4.抗 酒 石 酸 酸 性 磷 酸 酶(tartrate resistant acidphosphatase,TRAP)染色:将 BMMs 以 1 104个/孔的密度种于 96 孔板中,待细胞贴壁后。替换为含M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和不同浓度尿石素 A(0、4、8mol/L)的培养基诱导向破骨细胞分化,每 2 天换 1 次液,至第 5 天镜下观察到多核破骨细胞形成时。弃去孔内培养基,PBS 洗涤 3 遍,加入4%多聚甲醛固定 15min 后,弃去固定液,PBS 洗涤 3遍。加入 TRAP 染色液 37 避光染色 1
17、h,弃去染色液,PBS 洗涤。使用光学显微镜拍照,Image J 软件计数,细胞核大于 3 个的 TRAP 阳性细胞为破骨细胞。5.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quan-titative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测基因相对表达量:将 BMMs 以 2 105个/孔的密度种于6 孔板中,待细胞贴壁后,加入含 M-CSF(30ng/ml)、RANKL(50ng/ml)和不同浓度尿石素 A(0、4、8mol/L)的培养基诱导破骨分化。5 天后使用 Trizol 法提取总 RNA。Nanodrop 测 定 RNA 浓 度,使 用 Prim
18、e-ScriptTMRT Master Mix 试剂盒将 RNA 反转录为 cD-NA。将得到的 cDNA 2l 和 2 SYBR Green qPCRMaster Mix(Low ROX)5l、引物每个 0.4l、ddH2O2.2l 充分混合后,在 QuantStudio 6 荧光定量 PCR 仪进行检测。以 -actin 作为参照,用法来计算每个基因的相对表达水平,引物序列详见表 1。表 1引物序列基因名称引物序列(53)C-FOS上游引物:CGGGTTTCAACGCCGACTA下游引物:TTGGCACTAGAGACGGACAGACTSK上游引物:GAAGAAGACTCACCAGAAGCA
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