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莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制.pdf
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1、第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报(医学版)Journal of Jilin University(Medicine Edition)Vol.49 No.4Jul.2023DOI:10.13481/j.1671587X.20230410莫特塞尼与 EZH2抑制剂 GSK126联合应用对肝癌 Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制梁媛媛1,2,赵颂1,胡静1,安妮1,魏验芦1,苏荣健1(1.锦州医科大学基础医学院细胞生物学教研室,辽宁 锦州 121000;2.锦州医科大学附属第一医院风湿免疫科,辽宁 锦州 121000)摘要 目的目的:探讨多激酶抑制剂莫特塞尼联合果蝇 zest
2、e基因增强子的人类同源物 2(EZH2)抑制剂 GSK126 对肝癌 Huh7 细胞体外增殖和凋亡的影响,初步阐明其相关机制。方法方法:不同浓度(0、1、5、10、20、40和 60 mol L1)莫特塞尼处理 Huh7细胞,采用 CCK-8法检测各组 Huh7细胞增殖率,采用 Western blotting 法检测不同浓度(0、2.5、5.0、10.0 和 20.0 mol L1)莫特塞尼组 Huh7细胞中 EZH2和磷酸化 EZH2(p-EZH2)蛋白表达水平。莫特塞尼和 GSK126联合作用于 Huh7细胞,采用 CCK-8 法和克隆形成实验确定后 续 实 验 合 适 的 药 物 浓
3、度。Huh7 细 胞 分 为 对 照组、莫特塞尼(10 mol L1)组、GSK126(5 mol L1)组和联合组(莫特塞尼+GSK126),采用 5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色法检测各组 Huh7 细胞增殖率,流式细胞术检测各组 Huh7 细胞凋亡率,Western blotting 法检测各组 Huh7 细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化 ERK(p-ERK)、蛋白激酶 B(AKT)和磷酸化 AKT(p-AKT)蛋白表达水平。结果结果:CCK-8法检测,不同浓度莫特塞尼组 Huh7 细胞存活率随着药物浓度升高逐渐降低,与 0 mol L1 莫 特 塞 尼 组 比
4、较,20、40 和60 mol L1莫特塞尼组 Huh7 细胞增殖率明显降低(P0.05 或 P0.01);Western blotting 法检测,与 0 mol L1莫特塞尼组比较,5.0、10.0和 20.0 mol L1莫特塞尼组 Huh7细胞中 EZH2和 p-EZH2蛋白表达水平明显升高(P0.01)。通 过 CCK-8 法 和 克 隆 形 成 实 验 确 定 10 mol L1莫 特 塞 尼 和5 mol L1 GSK126用于后续实验。与对照组比较,莫特塞尼组、GSK126组和联合组 Huh7细胞增殖率明显降低(P0.01),细胞凋亡率明显升高(P0.05或 P0.01);与莫
5、特塞尼组和 GSK126组比较,联合组 Huh7细胞增殖率明显降低(P0.01),细胞凋亡率明显升高(P0.01)。与对照组、莫特塞尼组和 GSK126 组比较,联合组 Huh7 细胞中 p-AKT 和 p-ERK 蛋白表达水平明显降低(P0.05或 P0.01)。结论结论:单独应用莫特塞尼抑制肝癌 Huh7 细胞增殖和促进凋亡效果不明显,可能与EZH2 升高导致细胞耐药有关。莫特塞尼与 GSK126 联合应用可通过抑制 AKT 和 ERK 信号通路,增强莫特塞尼对肝癌 Huh7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。关键词 莫特塞尼;肝肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡;果蝇 zeste 基因增强子的人类同源物
6、2;GSK126中图分类号 R735.7文献标志码 A文章编号 1671587X(2023)04089609收稿日期 20220618基金项目 国家自然科学基金项目(81903109);辽宁省教育厅自然科学基金项目(2020-MS-299)作者简介 梁媛媛(1990),女,辽 宁 省 凌 海 市 人,在 读 硕 士 研 究 生,主要 从 事 肝 癌 治 疗 及 其 分 子 机 制 方 面 的研究。通信作者 苏荣健,教授,硕士研究生导师(E-mail:)896梁媛媛,等.莫特塞尼与 EZH2抑制剂 GSK126联合应用对肝癌 Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制Effect of motesan
7、ib combined with EZH2 inhibitor GSK126 on proliferation and apoptosis of liver cancer Huh7 cells and its mechanismLIANG Yuanyuan1,2,ZHAO Song1,HU Jing1,AN Ni1,WEI Yanlu1,SU Rongjian1(1.Department of Cell Biology,School of Basic Medical Sciences,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,China;2.Depar
8、tment of Rheumatoid Immunity,First Affiliated Hospital,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)ABSTRACT Objective:To discuss the effect of multi-kinase inhibitor motesanib combined with enhancer of zeste homolog 2(EZH2)inhibitor GSK126on the proliferation and apoptosis of the liver cancer Hu
9、h7 cells in vitro,and to clarify its related mechanism.Methods:The Huh7 cells were treated with different concentrations(0,1,5,10,20,40,and 60 mol L1)of motesanib.The proliferation rates of Huh7 cells in various groups were detected by CCK-8 assay;Western blotting method was used to detect the expre
10、ssion levels of EZH2 and phosphorylated EZH2(p-EZH2)proteins in the Huh7 cells in different concentrations(0,2.5,5.0,10.0,20.0 mol L1)of motesanib groups.The Huh7 cells were treated with motesanib and GSK126 in various groups;the appropriate drug concentrations were selected by CCK-8 assay and colon
11、y formation assay.The Huh7 cells were divided into control group,motesanib(10 mol L1)group,GSK126(5 mol L1)group,and combination(motesanib+GSK126)group.The 5-ethynyl-2-deoxyu ridine(EdU)fluorescence staining assay was used to detect the proliferation rates of Huh7 cells in various groups;the apoptot
12、ic rates of Huh7 cells in various groups were detected by flow cytometry;Western blotting method was used to detect the expression levels of extracellular regulated protein kinases(ERK),phosphorylated ERK(p-ERK),protein kinase B(AKT),and phosphorylated AKT(p-AKT)proteins in the Huh7 cells in various
13、 groups.Results:The CCK-8 assay results showed that proliferation rate of Huh7 cells in different concentrations of motesenib groups were decreased gradually with the increasing of drug concentrations;compared with motesenib(0 mol L1)group,the proliferation rates of the Huh7 cells in 20,40,and 60 mo
14、l L1 motesenib groups were decreased significantly(P0.05 or P0.01).The Western blotting results showed that compared with 0 mol L1 motesanib group,the expression levels of EZH2 and p-EZH proteins in the Huh7 cells in 5,10,and 20 mol L1 motesanib groups were increased(P0.05 or P0.01).The CCK-8 result
15、s and colony formation experiment results showed that 10 mol L1 motesanib and 5 mol L1 GSK126 could be used for the following experiment.Compared with control group,the proliferation rates of the Huh7 cells in motesanib group,GSK126 group,and combination group were significantly decreased(P0.05 or P
16、0.01);compared with motesanib group and GSK126 group,the proliferation rate of the cells in combination group was decreased(P0.01),and the apoptotic rate was increased(P0.01).Compared with control group,motesanib group and GSK126 group,the expression levels of p-AKT and p-ERK proteins in the Huh7 ce
17、lls in combination group were significantly decreased(P0.05 or P0.01).Conclusion:Motesanib alone has no significantly inhibitory effect on the proliferation and promoting effect on the apoptosis of the liver cancer Huh7 cells,which may be related to the increasing of EZH2 leading to the cell drug re
18、sistance.The combination of motesanib and GSK126 enhances the proliferation inhibition and pro-apoptotic effects of motesanib on the Huh7 cells by inhibiting AKT and ERK signaling pathways.KEYWORDS Motesanib;Hepatocellular carcinoma;Cell proliferation;Apoptosis;Enhancer of zeste homolog 2;GSK126897第
19、 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报(医学版)肝 细 胞 癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌最常见的类型,约占原发性肝癌患者总数的 90%以上1,由于其恶性度高、侵袭快和起病隐匿2-3,一般化疗药物难以取得令人满意的效果4,且单药治疗易出现耐药,探索新的 HCC治疗药物和用药方式是目前临床上亟待解决的问题。莫特塞尼作为一种酪氨酸激酶抑制剂,以血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血 小 板 衍 生 生 长 因 子(platelet derived growth factor
20、,PDGF)和干细胞因子受体为靶点发挥作用5,在甲状腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌模型中均表现出较强的抗肿瘤效果,单药治疗和联合化疗可导致肿瘤消退并抑制肿瘤血管形成和生长6,但对肝癌的治疗作用目前尚不清楚。果 蝇 zeste 基 因 增 强 子 的 人 类 同 源 物 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因过表达发生在多种人类恶性肿瘤中,EZH2 高表达可导致肿瘤细胞耐药7。GSK126 是一种有效的 EZH2 抑制剂,抑制 EZH2甲基转移酶的活性可能是治疗高EZH2 活性癌症的一个可行策略,进而发挥靶向抗癌作用8。本研究通过观察莫特塞尼和 GSK1
21、26联合应用对人肝癌 Huh7 细胞增殖和凋亡的影响,并初步阐明其相关机制,为临床肝癌患者的治疗和合理用药提供实验依据。1 材料与方法 1.1细胞细胞、主要试剂和仪器主要试剂和仪器人肝癌 Huh7 细胞(中国科学院上海细胞库)。DMEM 培养基和胎牛血 清(美 国 Gibco 公 司),苯 甲 基 磺 酰 氟(benzenesulfonylfluoride,PMSF)(美 国 Sigma 公司),胰酶消化液、RIPA 裂解液和蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物科技(上海)有限公司,莫特塞尼(美国 Selleckchem 公司),CCK-8试剂盒(美国 GlpBio 公司),5-乙 炔 基-2 脱
22、氧 尿 嘧 啶 核 苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine,EdU)试剂盒(广州锐博生物科技有限公司),一抗 EZH2、磷酸化 EZH2(phosphorylated EZH2,p-EZH2)、细胞外信号调节 激 酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷 酸 化 ERK(phosphorylated ERK,p-ERK)、蛋 白 激 酶 B(protein kinase B,AKT)和 磷 酸 化 AKT(phosphorylated AKT,p-AKT)抗体及-actin 抗体和 HRP 标记的二抗(美国 CST公司)。低
23、速离心机购于美国 Thermo公司。1.2 细 胞 培 养 和 分 组细 胞 培 养 和 分 组 Huh7 细 胞 接 种 于 含10%FBS 和 1%青-链霉素的 DMEM 培养基中,在37、5%CO2条件下传代培养,取对数生长期细胞进行后续实验。1.3CCK-8 法检测不同浓度莫特塞尼组及莫特塞法检测不同浓度莫特塞尼组及莫特塞尼与尼与 GSK126 联合应用后各组联合应用后各组 Huh7 细胞增殖率细胞增殖率取状态良好的对数生长期 Huh7 细胞,计数后以每孔 5103 个细胞的密度均匀铺于 96 孔细胞培养板中,每组设 5 个复孔,置于 37、5%CO孵箱中培 养 24 h 后,分 别
24、加 入 0、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 和 60.0 mol L1莫特塞尼。莫特塞尼按 0、5.0 和 10.0 mol L1浓度给药,GSK126 按0、1.0、2.5和5.0 mol L1浓度给药,即分别为对照组,1.0、2.5 和 5.0 mol L1 GSK126 组,5.0 和10.0 mol L1莫特塞尼组,不同浓度莫特塞尼+不 同浓度 GSK126 组。培养 48 h,每孔加入 10 L CCK-8,再继续孵育0.51.0 h,每隔30 min低速震荡 10 s,采用酶联免疫分析仪检测波长 450 nm 处每孔吸光度(A)值,计算各组细胞增殖率。细胞增殖 率=(
25、实验组 A 值空白组 A 值)(对 照 组A值空白组 A值)100%。实验重复 3次。1.4 Western blotting 法 检 测 各 组法 检 测 各 组 Huh7 细 胞 中细 胞 中EZH2和和 p-EZH2蛋白表达水平蛋白表达水平Huh7细胞分为 0、2.5、5.0、10.0 和 20.0 mol L1莫特塞尼组。采用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液提取各组细胞总蛋白,使用 BCA 工作液对提取的蛋白进行定量分析。10%SDS-PAGE 电泳分离等量蛋白质将其电转移至 PVDF 膜上,2%BSA 室温封闭 2 h,随后加入 EZH2和 p-EZH2抗体,4 过夜孵育,次白 TB
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