‘沙糖橘’S蛋白同源基因CrSPH的克隆与表达分析.pdf
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1、西北植物学报,2 0 2 3,4 3(8):1 2 6 1-1 2 6 7A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 8.1 2 6 1 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 3-0 3-3 0;修改稿收到日期:2 0 2 3-0 5-2 6基金项目:国家外专局项目(QN 2 0 2 2 0 3 0 0 2 5 L);肇庆学院博士科研启动基金项目(6 1 1-
2、6 1 2 2 8 1)作者简介:吴秀兰(1 9 7 8-),女,博士,副教授,主要从事柑橘遗传育种与分子生物学研究。E-m a i l:1 0 8 4 4 2 6 4q q.c o m*通信作者:唐文武,博士,教授,主要从事植物遗传育种与分子生物学研究。E-m a i l:w w t a n g z q u.e d u.c n 沙糖橘S蛋白同源基因C r S P H的克隆与表达分析吴秀兰1,唐文武2*,徐呈祥2,李桂花3(1 肇庆学院 食品与制药工程学院,广东肇庆 5 2 6 0 6 1;2 肇庆学院 生命科学学院,广东肇庆 5 2 6 0 6 1;3.广东省农业科学院蔬菜研究所,广州 5
3、1 0 6 4 0)摘 要:柑橘自交不亲和由S位点基因控制,前期S S H文库中筛选出1个自交不亲和相关的S蛋白同源基因(S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e,S PH),但其功能尚不明确。研究以 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 为材料,利用反转录P C R技术克隆C r S PH基因,通过q P C R技术分析该基因表达特性,并进行原核表达和花粉萌发实验。结果表明,(1)C r S PH的C D S长度为4 1 7 b p,编码1 3 8个氨基酸,两材料间的C D S区存在3个碱基替换,引起2个氨基酸突变。(2)S o u t h e r n杂交实验
4、表明,C r S PH基因在两材料基因组中均以单拷贝形式存在。(3)q P C R实验表明,C r S PH基因在 沙糖橘 花器官不同部位表达差异显著,子房中表达量最大,花瓣、花丝等组织中表达量均较低;在高表达的子房中,沙糖橘 表达量是 无籽沙糖橘 的1 6倍,表明C r S PH基因在 沙糖橘 中具有高度的组织表达特异性。(4)C r S PH基因在异交授粉第6,7天表达量最高,与其他时段差异均达到显著水平,第6天表达量是第1天表达量的1 2.4倍。(5)原核表达实验成功诱导出C r S P H蛋白,离体花粉萌发实验表明,随着异源 无籽沙糖橘C r S P H蛋白浓度的增加,无籽沙糖橘 萌发
5、率受到显著的抑制。研究表明,C r S PH基因具有表达特异性,可能与柑橘自交不亲和有关。关键词:沙糖橘;C r S PH;表达分析;花粉萌发;自交不亲和中图分类号:Q 9 4 3.2;S 6 6 6文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f t h e S-p r o t e i n H o m o l o g o u s G e n e(C r S P H)f r o m S h a t a n g j uWU X i u l a n1,T ANG W e n w u2*,XU C h e n g x
6、 i a n g2,L I G u i h u a3(1 S c h o o l o f F o o d a n d P h a r m a c e u t i c a l E n g i n e e r i n g,Z h a o q i n g U n i v e r s i t y,Z h a o q i n g,G u a n g d o n g 5 2 6 0 6 1,C h i n a;2 S c h o o l o f L i f e S c i e n c e s,Z h a o q i n g U n i v e r s i t y,Z h a o q i n g,G u a
7、 n g d o n g 5 2 6 0 6 1,C h i n a;3 V e g e t a b l e R e s e a r c h I n s t i t u t e,G u a n g d o n g A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s,G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 0,C h i n a)A b s t r a c t:S e l f-i n c o m p a t i b i l i t y i n C i t r u s w a s c o n t r o l l e d
8、 b y t h e S l o c u s g e n e,o n e s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y r e l a t e d S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e(S PH)w a s s c r e e n e d f r o m S S H l i b r a r y i n t h e e a r l y s t a g e,b u t i t s f u n c t i o n i s s t i l l u n c l e a r.I n t h e s t u d y,t h e
9、S PH g e n e w a s c l o n e d f r o m Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u b y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n P C R,n a m e d C r S PH.T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e C r S PH g e n e w a s a n a l y z e d b y q P C R.T h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o
10、n a n d p o l l e n g e r m i n a t i o n e x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e d.T h e r e s u l t s s h o w e d,(1)t h e C D S o f S PH g e n e w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d f r o m Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a t a n g j u,a n d t h e C D S w a s 4 1 7 b p e n c
11、 o d i n g a p r o t e i n o f 1 3 8 a m i n o a c i d s.T h e r e w e r e t h r e e b a s e p a i r s d i f f e r e n c e b e t w e e n Wu z i s h a-t a n g j u a n d S h a t a n g j u,w h i c h r e s u l t e d i n t w o a m i n o a c i d s m u t a t i o n.(2)T h e s o u t h e r n h y b r i d i z a
12、 t i o n e x-p e r i m e n t s h o w e d t h e r e w a s o n e c o p y o f C r S PH i n t h e g e n o m i c D NA b o t h Wu z i s h a t a n g j u a n d S h a-t a n g j u.(3)T h e q P C R s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f C r S PH g e n e w a s s i g n i f i c a n t l y d i
13、f f e r e n t i n f l o w e r o r g a n s o f S h a t a n g j u,t h e h i g h e s t e x p r e s s i o n l e v e l w a s f o u n d i n o v a r y,a n d i t w a s h a r d l y e x p r e s s e d i n p e t a l s,f i l a m e n t s,a n t h e r s,s t i g m a s,s t y l e s.T h e r e l a t i v e e x p r e s s
14、i o n l e v e l o f C r S PH g e n e w a s 1 6 t i m e s h i g h e r i n t h e o v a r i e s o f S h a t a n g j u t h a n t h a t i n o v a r i e s o f Wu z i s h a t a n g j u.(4)T h e h i g h e s t e x p r e s s i o n o f t h e C r S PH g e n e w a s d e t e c t e d a t t h e 6t h a n d 7t h d a
15、f t e r o u t c r o s s i n g(Wu z i s h a t a n g j uS h a t a n g j u)p o l l i n a t i o n,a n d t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e t h a n t h e e x p r e s s i o n o f t h e C r S PH g e n e a t o t h e r p e r i o d s,t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l
16、 o f C r S PH g e n e a t 6 d w a s 1 6 t i m e s h i g h e r t h a n t h a t a t 1 d.(5)T h e p r o k a r y-o t i c e x p r e s s i o n e x p e r i m e n t s u c c e s s f u l l y i n d u c e d t h e C r S P H h e t e r o l o g o u s p r o t e i n,a n d t h e p o l l e n g e r m i n a-t i o n e x p
17、 e r i m e n t i n v i t r o s h o w e d t h a t t h e p o l l e n g e r m i n a t i o n r a t e o f Wu z i s h a t a n g j u w a s s i g n i f i c a n t l y i n-h i b i t e d w i t h i n c r e a s i n g C r S P H p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s f r o m Wu z i s h a t a n g j u.T h e a b o
18、 v e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e C r S P H g e n e h a d t i s s u e e x p r e s s i o n s p e c i f i c i t y.W e s p e c u l a t e d t h a t t h e C r S P H g e n e m a y b e r e l a t e d t o s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y o f C i t r u s.K e y w o r d s:S h a t a n g j u;C r S
19、 PH;e x p r e s s i o n a n a l y s i s;p o l l e n g e r m i n a t i o n;s e l f-i n c o m p a t i b i l i t y 在显花植物中,自交不亲和性(s e l f-i n c o m p a t i-b i l i t y,S I)被认为是防止自花授粉、促进异花授粉及产生新基因型的重要遗传机制。S I是由1个单一的复等位基因S位点所控制,以实现接受还是排斥自我的花粉1。S I系统可分为孢子体S I(s p o r o-p h y t i c S I,S S I)和 配 子 体S I(g a
20、m e t o p h y t i c S I,G S I)。S S I和G S I由不同的S位点基因控制,以十字花科为代表的S S I 主要由S位点的S R K(S-r e-c e p t o r k i n a s e)和S C R(S-l o c u s p r o t e i n 1 1)基因控制2。这2个紧密连锁的S位点基因在柱头的乳突细胞中特异性表达,并在S I中控制柱头的功能3。以茄科为代表的G S I主要由雌蕊中的S-RN a s e和花粉 中S L F(S-l o c u s F-b o x)/S F B(S-h a p l o t y p e-s p e c t i f i
21、 c F-b o x)基因控制4。有关S-RN a s e研究较多,玄参科5、蔷薇科6、芸香科7、在茄科8等均有报道,不同S-RN a s e之间存在高度的多态性,其氨基酸序列的同源性介于3 8%9 8%之间9。在花粉S位点基因研究方面,L a i等1 0从金鱼草的B A C文库中筛选到1个A h S L F-S2基因,该基因与S2-R N a s e紧密连锁。S a s s a等1 1在梨中鉴定了5个F-b o x基 因,均 位 于Sn-RN a s e基 因 附 近。B e e c h e r等1 2报道除了关键S因子外,其他非关键因子也参与自交不亲和反应,如P C D1 3、S S K
22、11 4、C r S K P 1-e1 5、B r CML 4 91 6等。柑橘 属 于S-R N a s e介 导 的G S I,由 花 柱S-R N a s e和花粉S L F相互作用,通过抑制花粉管的生长实现自交不亲和性1 7。当花柱S-R N a s e进入花粉管后,非自我S-R N a s e会被S L F识别并被泛素化及降解,花粉管能正常延伸至子房受精。当自我S-R N a s e释放到花粉管中,会降解花粉管中的R NA,使得花粉管无法在花柱中生长,表现出自交不亲和反应1 8。沙糖橘是中国重要的柑橘品种,属于自交亲和品种。无籽沙糖橘 是 沙糖橘 的芽变体,属于G S I1 9-2
23、0,是研究自交不亲和的理想材料。课题组前期从无籽沙糖橘S S H文库中筛选到1个自交不亲和相关的E S T序列,序列比对为S-蛋白同源基因(S-p r o t e i n h o m o l o g o u s g e n e,S PH),柑橘S PH基因的相关研究尚未见报道。本研究以甜橙(C i t-r u s s i n e n s i s)的S PH基因序列(C s 5 g 3 4 5 8 0.1)为参照,克隆了 沙糖橘C r S PH基因的C D S和D NA序列,并分析其在花器官不同部位、授粉后不同时段的表达量,同时研究该蛋白对 无籽沙糖橘、沙糖橘 花粉萌发率的影响,以期为研究C r
24、 S PH基因功能及在柑橘自交 不亲和反应 中 的 作 用 机 制 提 供依据。1 材料和方法1.1 试验材料试验用 无籽沙糖橘 及 沙糖橘 果树由肇庆市德庆县马圩镇果园提供,为7年生果树。于2 0 1 9年春季收集含苞待放花蕾,用镊子剥离出花瓣、花丝、柱头、花柱、子房、花丝和花药,液氮速冻后置于-8 0 冰箱,用于不同组织表达分析。收集自交(无籽沙糖橘 无籽沙糖橘)、异交(无籽沙糖橘 沙糖橘)后0,1,2,3,4,5,6,7 d的雌蕊,液氮速冻后置于-8 0 冰箱,用于授粉后不同时段的表达分析。收集 无籽沙糖橘 和 沙糖橘 花粉,置于-2 0 冰箱保存,用于体外花粉萌发实验。2621西 北
25、植 物 学 报 4 3卷1.2 试验方法1.2.1 C r S P H基因克隆采用R NA提 取 试 剂 盒 提 取 总R NA,采 用C T A B法2 1提取基因组D NA,采用L i f e T e c h n o l o-g y公司生产的M-ML V反转录试剂盒合成c D NA。参考甜橙S PH基因序列(C s 5 g 3 4 5 8 0.1)设计1对包含起始密码子和终止密码子的引物C r S P H-F/R(表1),扩增C r S PH基因的C D S和D NA序列,扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳并回收,获得目的基因片段。将目的基因与p MD 1 9-T克隆载体连接并转化感受态细胞
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