渴络欣对2型糖尿病肾病大鼠模型肾脏氧化应激和炎症反应的影响.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究渴络欣对2型糖尿病肾病大鼠模型肾脏氧化应激和炎症反应的影响杨小梅1,周倩1,韩栩珂1,高阳1,陈秋2(1.成都中医药大学临床医学院 成都 610075;2.成都中医药大学附属医院 成都 610072)摘要:目的研究渴络欣胶囊对2型糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)模型大鼠肾脏氧化应激和炎症反应的影响。方法通过注射链脲佐菌素(Strep
2、tozocin,STZ)和高脂肪、高糖饮食诱导DN模型大鼠,将模型大鼠随机分为DN组(模型组)、渴络欣组及厄贝沙坦组,每组8只。另选8只同龄大鼠作为正常组。正常组和模型组大鼠灌胃予生理盐水(10 mLkg-1d-1),渴络欣组大鼠灌胃予渴络欣胶囊制备的渴络欣混悬液(0.63 gkg-1d-1),厄贝沙坦组大鼠灌胃予厄贝沙坦混悬液(15.6 mgkg-1d-1)。8周后,检测每组大鼠的空腹血糖(FBG)、尿微量白蛋白(MAU)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和炎症因子IL-1、IL-6、IL-33、TNF-、TGF-的水平,并观察肾组织病理改变。结果模型组大鼠可见肾小球系膜增生、
3、囊壁增生、肾小管扩张及上皮细胞气球样变等一系列病理改变,且肾脏纤维化严重,渴络欣治疗后上述肾脏病理现象减轻;与正常组相比,模型组大鼠SOD活性明显降低,MDA含量和IL-1、IL-6水平显著升高(P0.01);与模型组相比,渴络欣组大鼠SOD活性显著升高,MDA含量显著降低(P0.01),IL-1和TNF-水平明显降低(P 0.05)。结论渴络欣胶囊能有效抑制糖尿病肾病模型大鼠的氧化应激和炎症水平,减轻肾脏病理学变化,延缓DN的病程进展。关键词:糖尿病肾病 渴络欣 氧化应激 炎症反应doi:10.11842/wst.20220107008 中图分类号:R285.5 文献标识码:A糖尿病肾病(D
4、iabetic kidney disease,DKD)是最常见的糖尿病(Diabetes mellitus,DM)微血管并发症之一1,易发展成终末期肾病2,其主要的病理改变涉及肾小球系膜增生、细胞外基质改变、肾小管间质纤维化和肾小球硬化等3-4,临床表现主要是肾功能不全和大量蛋白尿的产生。DKD 的发病是多种因素导致的5,其具体的发病机制尚未完全明确,但大量研究表明氧化应激和炎症是引起 DN 发生与进展的重要因素6-7。氧化应激是因体内氧化与抗氧化防御机制遭到破坏导致活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的增加,从而引发足细胞凋亡、炎症反应等损伤细胞8。研究显示,抑制
5、氧化应激可改善与糖尿病肾病相关的临床表现,这也证实了抗氧化应激反应在DKD发展中的重要意义9-10。炎症被认为是DKD发生进展的关键因素,促炎因子 TNF-、IL-1和 IL-6等可进一步加重患者肾脏的炎症反应和纤维化程度,促进 DKD 的进展11-13。氧化应激和炎症反应在糖尿病肾病环境中相互影响,活性氧的增加可以导致炎症细胞因子的产生,同时,炎症细胞因子的增加也可以引起自由基的产生,二者相互作用参与了DKD肾脏的损伤机制14。大量研究表明,高血糖(Hyperglycaemia,HG)和晚期糖基化终产物(Late glycosylate end products,AGEs)可促 收稿日期:2
6、022-01-07 修回日期:2022-07-10 北京医卫健康公益基金会医学科学研究基金(YWJKJJHKYJJ-KH2019005):具有益气养阴、活血化瘀功效的中成药对糖尿病肾病大鼠肾脏的影响,负责人:陈秋。通讯作者:陈秋,博士生导师,主要研究方向:内分泌代谢性疾病的中西医结合防治的临床研究。1177 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 进活性氧的产生15,引发机体产生氧化应激,并同时
7、激活炎症小体 NLRP316-17,上调炎症转录因子(NF-B)的表达,导致IL-1和TNF-等促炎因子的分泌18-21。可见,高糖环境下氧化应激和炎症相互影响,加重DKD的肾脏损害22-23。因此,氧化应激和炎症被认为是DN的重要发病机制24-26,抑制氧化应激和炎症反应可能是缓解高血糖所致肾损伤的有效途径。近年来中医药在慢性肾脏疾病中的治疗作用受到广泛研究27-28。糖脂代谢调节、抗氧化、抗炎、抗纤维化和足细胞保护等已经被确定为保护肾脏的重要分子机制29-32。中医认为DN的病理特征为本虚标实,本虚是指气血、阴阳、脾肾亏虚,标实则是指湿、浊、痰、瘀等病理产物31,故治疗DN的基本法则应围绕
8、益气养阴、活血化瘀进行。研究已表明,黄芪甲苷可通过抑制内质网应激减少DN大鼠的尿蛋白、改善系膜细胞的凋亡、缓解肾小球硬化、改善DN大鼠的肾脏病理学改变33-34。Liu 等35通过体内和体外实验研究表明,Rg1能通过调节PI3K/AKT/FOXO3通路对DN导致的炎症和氧化应激有改善作用。研究显示,人参皂苷Rg1能够减轻 DN大鼠的氧化应激水平、抑制细胞凋亡、减轻大鼠肾病理改变、延缓肾纤维化进程36-37。大黄能够有效地缓解DN大鼠的肾脏纤维化38,抑制氧化应激和细胞外基质的积聚,从而减轻糖尿病肾损害39。二黄方(大黄和黄芪)可通过抑制炎症和纤维化改善腺嘌呤诱导的肾损伤40。水蛭素能够有效地降
9、低肾小管上皮细胞炎症因子水平,抑制肾脏纤维化41。王娟等42研究表明,女贞子可作用于DN的多个信号通路,在调节机体的氧化应激、炎症反应和糖脂代谢等方面作用显著。药理实验表明,川芎提取物不仅能显著减轻DN大鼠的临床症状和肾脏损伤,而且抑制炎症和氧化应激的作用也很显著43。研究已证实,枸杞子中富含的甜菜碱成分有调节脂质代谢、抗炎、缓解胰岛素抵抗、改善线粒体功能等作用,能减轻DM引起的肾功能损伤44。以上研究表明,益气养阴活血的中医药在DN的治疗中扮演了重要角色,通过抗炎、抗氧化治疗DN也是一个有效的途径。本研究中渴络欣胶囊的药物组成包括黄芪、太子参、大黄、水蛭、枸杞子和女贞子六种药物,共凑益气养阴
10、、活血化瘀的功效,符合中医治病的整体观念原则45。既往研究已表明,这几味中药在DN中的治疗作用已受到大量研究和应用,其在抑制氧化应激、减轻炎症反应、缓解肾脏病理损伤等方面的作用早已被明确。因此,猜测渴络欣胶囊可能通过减轻DN大鼠的氧化应激和炎症反应,改善DN引发的肾损伤。目前,对渴络欣胶囊治疗DN的作用机制的研究尚少,故本研究通过使用高糖、高脂饲料联合STZ并加以改良的方法建造DN大鼠模型,观察渴络欣胶囊对DN大鼠肾脏氧化应激及炎症水平的影响及其可能机制。1 材料与方法 1.1材料动物:32只SPF级健康SD雄性大鼠(由成都达硕实验动物有限公司提供,许可证号:SYXK(川)2019-189),
11、体质量(200 20)g,所有大鼠被安置在一个特定的无病原体(SPF)动物房间适应性喂养1周,温度保持在(24 1),定期12 h光/暗周期,在实验开始前自由饮食摄水。药物:渴络欣胶囊,购自成都康弘制药公司,0.5 g,1911002;厄贝沙坦片,购自上海源叶生物科技公司,150 mg,S27F8D30066。主要试剂:Rat MAU(MAU,ZC-36389)、Rat IL-1 ELISA KIT(IL-1,ZC-36391)、Rat IL-6 ELISA KIT(IL-6,ZC-36404)、Rat IL-33 ELISA KIT(IL-33,ZC-36399)、Rat TGF-ELISA
12、 KIT(TGF-,ZC-37644)、Rat TNF-ELISA KIT(TNF-,ZC-37624)均购自上海茁彩生物科技有限公司生产;总蛋白测定试剂盒(TP,A045-2-2)、总超氧化物歧化酶测试盒(T-SOD,A002-1-2)和丙二醛测定试剂盒(MDA,A003-1-2)均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器:计算机,冠捷显示科技有限公司生产;酶标仪,美谷分子仪器有限公司生产;优普超纯水制造系统,成都超纯科技有限公司生产;电子恒温水浴锅,北京中兴伟业仪器有限公司生产;手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂生产;移液枪,北京大龙兴创实验仪器有限公司生产;枪头、EP管,美国 A
13、xygen 公司生产;转轮式切片机(徕卡-2016,德国);JT-12S自动组织脱水机,武汉俊杰电子有限公司生产;RS36型全自动染色机,常州派斯杰医疗设备有限公司生产;BMJ-A型包埋机,常州郊区中威电子仪器厂生产;PHY-型病理组织漂烘仪,常州市中威电子仪器有限公司生产;数字切片扫描仪(Pannoramic 250),济南丹吉尔电子有限公司生产。1178 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究1
14、.2方法1.2.1实验动物分组及处理随机挑选8只SPF级健康SD雄性大鼠为正常组,其余 24 只进行造模。造模采用高糖高脂饲料联合STZ的方法并加以改良46,将大鼠适应性喂养1周后,正常对照组予普通饲料喂养,其余造模组予高糖高脂饲料(蔗糖10%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆固醇2%、猪胆盐0.25%及普通饲料67.75%)喂养(高糖高脂饲料由成都达硕实验动物有限公司提供)。4周后,通过外科手术摘除大鼠右侧肾脏,术后2周给造模组大鼠进行单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ,40 mgkg-1)造模,正常组予以等量的生理盐水。72 h后,尾静脉采血测量大鼠血糖,血糖值16.7 mmolL-1,即可确定为
15、DN大鼠造模成功。将成模大鼠分为3组,即DN组(简称模型组)、渴络欣组、厄贝沙坦组,每组8只。正常组和模型组大鼠分别予生理盐水(10 mLkg-1d-1),渴络欣组大鼠给予渴络欣胶囊制备的渴络欣混悬液(0.63 gkg-1d-1),厄贝沙坦组大鼠给予厄贝沙坦混悬液(15.6 mgkg-1d-1)。各组连续灌胃8周。本次动物实验均经过成都达硕实验动物公司伦理委员会同意。1.2.2生化指标检测药物干预结束前1天,检测各组大鼠空腹血糖水平,并将各组实验大鼠放入代谢笼中,采集尿液并检测尿微量白蛋白(MAU)。实验结束前,采用腹腔注射10%水合氯醛(0.33 mLkg-1)麻醉,经腹主动脉穿刺采集动脉血
16、,并使用 ELISA 试剂盒检测总蛋白(TP)、MDA含量、SOD活性和炎症因子IL-1、IL-6、IL-33、TNF-、TGF-等相关指标。1.2.3肾脏病理组织学观察采血后处死大鼠,摘取各组大鼠左侧肾脏,记录质量后储存在10%福尔马林溶液中。用4%多聚甲醛固定48 h,然后脱水,嵌入石蜡,制作成4 m切片用于组织学观察。切片用苏木精-伊红(HE)染色、过碘酸-希夫(PAS)和马森(Masson)染色。用光显微镜观察肾脏组织的形态。1.2.4统计学方法用 SPSS 22.0 软件进行统计学处理,数据以平均值标准差(x s)表示,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行数据的组间显
17、著性检验,若方差齐,组间进行两两比较用LSD检验,若方差不齐用新复极差法(Dunnett7 T3)检验。P0.05被认为差异有统计学意义。2 结果 2.1一般情况的变化如图1所示,与正常组相比,8周后模型组大鼠肾脏质量明显增加(P0.05),且FBG和MAU水平显著升高(P0.01)。与模型组相比,渴络欣组大鼠肾脏质量和 FBG 明显下降(P0.05),MAU 水平显著降低(P0.01);厄贝沙坦组MAU水平明显降低(P0.05),肾脏质量和空腹血糖水平也有降低,但差异无统计学意义。2.2氧化应激指标比较如图2所示,与正常组相比,模型组大鼠SOD活性明显减少,MDA含量显著增高(P0.01)。
18、与模型组相比,渴络欣组大鼠SOD活性明显升高,MDA含量显著降低(P0.01)。厄贝沙坦组大鼠 SOD活性也显著升高(P0.01),MDA含量明显降低(P0.05)。2.3炎症因子指标比较如图3所示,与正常组相比,模型组大鼠肾匀浆中的IL-1、IL-6浓度显著升高(P0.01),IL-33、TGF-和TNF-浓度有一定的升高,但差异无统计学意义。图1各组大鼠肾脏质量、空腹血糖和MAU水平水平比较(x s,n=8)注:与正常组相比,*P0.05,*P0.01;与模型组相比,#P0.05,#P0.01。1179 Modernization of Traditional Chinese Medici
19、ne and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 与模型组相比,渴络欣组大鼠肾匀浆中IL-1和TNF-浓度明显降低(P0.05),IL-6、IL-33和TGF-浓度也有所降低,但差异无统计学意义;厄贝沙坦组大鼠肾匀浆中IL-6和TGF-浓度显著下降(P0.05)。2.4肾脏病理组织学变化如图4所示,HE染色显示正常组大鼠肾小球结构完整,肾小管排列整齐,肾间质无炎性细胞浸润。与正常组相比,模型组可见肾小球系膜增生、囊壁增生、肾小管扩张及上皮细胞气球样变等病理改变,该病变基本符合糖尿病性肾病的
20、病理改变,提示本实验糖尿病性肾病模型造模基本成功,但造模程度相对较轻;与模型组相比,渴络欣组和厄贝沙坦组大鼠上述肾脏病理现象有轻度减少,可能与治疗周期较短有关。Masson染色结果中,蓝色面积代表肾纤维化的程度,正常组大鼠肾间质中只有少量的蓝色面积。与正常组相比,模型组大鼠的肾组织中有大量的蓝色区域,表明有严重的肾纤维化。渴络欣和厄贝沙坦治疗后,大鼠肾组织中的蓝色区域显著减少。PAS染色显示正常组大鼠的肾小球基底膜完整,未见细胞外基质沉积,与正常组相比,模型组大鼠的肾小球和肾小管基底膜有不规则增厚。与模型组相比,渴络欣和厄贝沙坦组大鼠的肾小球基底膜增厚较轻。图3治疗8周后各组炎症因子水平比较(
21、x s,n=8)注:与正常组相比,*P0.01;与模型组相比,#P0.05,#P0.01。图2治疗8周后各组氧化应激指标水平比较(x s,n=8)注:与正常组相比,*P0.01;与模型组相比,#P0.05,#P0.01。1180 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化动物模型与动物实验研究3 讨论 目前,DN的发病机制尚未完全明确。研究表明,肾脏血流动力学变化、氧化应激、炎症、缺氧等因素的过度活跃都参与了DN的发病机制4
22、7。其中氧化应激和炎症被多数研究证明与 DN 的发病与进展联系甚大48。基础研究显示,慢性高血糖可导致大鼠肾脏中氧化应激和炎细胞因子等的显著升高,通过抑制氧化应激和炎症反应可明显缓解高糖引起的肾损害49-50。中医中药对DN的治疗疗效显著51-52,且严重的不良反应相对于西医药更少,在临床上受到许多患者欢迎,显示出很大的治疗前景。大量研究表明,中医药通过调节氧化应激和炎症可以改善DN进展53-54。本研究中的渴络欣胶囊对DN大鼠的氧化应激和炎症方面也显示出了良好的治疗作用。近年来,中医药通过抑制氧化应激和炎症治疗DN的研究颇多。Zhang等55研究表明藏红花素可通过抑制NLRP3炎症小体来减轻
23、DKD相关的氧化应激和炎症反应。Sun等56研究显示,大黄素能减轻高糖诱导 的 氧 化 应 激、炎 症 和 细 胞 外 基 质(Extracellular matrix,ECM)的积累,减轻肾脏的损伤。Chen 等57研究表明丹参酮IIA能缓解DM引起的肾损伤,其机制与减轻氧化应激和炎症反应有关。Li58等研究发现化瘀通络方能减轻DN大鼠的氧化应激和炎症水平,减少细胞外基质(ECM)的积累,其作用机制与激活AMPK/Nrf2信号通路有关。研究表明,中药川芎根茎提取物可通过抑制DN模型的氧化应激和炎症水平,减轻STZ诱导的 DN 模型肾脏的病理损害59。天麻素可激活AMPK/Nrf2信号通路,减
24、轻高糖下 MPC5细胞的炎症反应、氧化应激和细胞凋亡60。研究发现人参皂苷Rg3不仅能降低DN小鼠的空腹血糖水平,而且还能改善胰岛素(INS)水平、血脂、氧化应激和肾功能,对DN小鼠有明显的改善作用61。研究表明,中成药黄葵胶囊 可 减 轻 DN 大 鼠 模 型 氧 化 应 激 和 肾 纤 维 化,p38MAPK/Akt信号通路的下调可能是其潜在的作用机制62。研究显示,丹蛭降糖胶囊能降低炎症和氧化应激水平,改善糖尿病性肾功能不全及其相关病理63。这些研究表明,在高糖环境下氧化应激和炎症水平有明显的升高,中医药通过减轻氧化应激和炎症水平治疗DN是一个重要的途径,显示了中医药治疗DN的广阔前景。
25、本研究中,采用由黄芪、太子参、大黄、水蛭、枸杞子和女贞子组成的中成药渴络欣胶囊治疗DN大鼠,体现了中医益气养阴、活血化瘀的治疗原则。研究结果显示,渴络欣胶囊不仅能改善DN大鼠的血糖和尿微量白蛋白水平,对氧化应激和炎症反应也有明显的改善作用,能减轻肾脏纤维化程度,这也显示了中医经典治则的显著疗效。渴络欣胶囊作为一种益气养阴、活血化瘀的中成药,在治疗糖尿病并发症方面有不错的疗效。既往研究表明,渴络欣可抑制高糖诱导大鼠的系膜细胞增图4渴络欣对DN诱导大鼠肾组织组织形态学变化的影响注:HE、Masson和PAS染色观察肾组织(400)。1181 Modernization of Traditional
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