基于非靶向代谢组学的槟榔花香关键代谢物的筛选.pdf
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1、热带作物学报 2023,44(7):13281336 Chinese Journal of Tropical Crops 收稿日期 2022-06-07;修回日期 2022-09-07 基金项目 海南省槟榔现代农业产业技术体系项目(No.HNARS2022-1-G3);海南省教育厅高等学校科学研究项目(No.Hnky2019 ZD-7)。作者简介 辛晓栋(1997),男,硕士研究生,研究方向:作物栽培与耕作。*通信作者(Corresponding author):杨福孙(YANG Fusun),E-mail:。基于非靶向代谢组学的槟榔花香关键代谢物的筛选 辛晓栋,温欣宇,降佳君,王 玲,杨国斌
2、,杨福孙*海南大学热带作物学院,海南海口 570228 摘 要:为了筛选出控制槟榔花香的关键代谢物,提升槟榔花香,吸引更多授粉者,从而提高槟榔产量。本研究采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联合分析技术对不同时期槟榔花进行非靶向代谢组学检测。结果共检测到 236 种代谢物。利用 VIP 值和差异倍数相结合的方法共筛选出 75 种差异代谢物,主要包括萜类、酮类、醇类等。其中槟榔雌花的挥发性化合物从雌花未开期到初开期发生大量积累,在盛开期又发生轻微下降,所以雌花初开期可能是槟榔雌花花香形成的关键时期。槟榔雄花的挥发性化合物在雄花初开期到盛开期发生了大量积累,所以雄花盛开期可能是槟榔雄花花香形成的关键时期
3、。之后对差异代谢物使用 KEGG 数据库对其代谢途径进行分析,筛选与植物花香有关且富集显著的代谢通路。结果表明:槟榔雌花中富集显著且与花香合成有关的代谢途径为脂肪酸生物合成,在该通路上富集的物质为癸酸。癸酸是一种脂肪酸类物质,其多用于植物生理和信号传递等功能,槟榔雌花未开期到初开期癸酸含量上调,花香释放量也发生相应的提升,这可能是由于槟榔在雌花初开期开始授粉,需要传递更多的化学信号,从而吸引授粉者。所以癸酸可能是槟榔雌花为了授粉而释放的一种化学信号。槟榔雄花中富集显著且与花香合成有关的代谢途径分别为双萜类生物合成和脂肪酸降解,棕榈醛和(4aR,6aS,9R,11aR,11bR)-4,4,11b
4、-三甲基-8-亚甲基十四氢-6a,9-甲基环庚a萘分别富集在这 2 条代谢途径上。(4aR,6aS,9R,11aR,11bR)-4,4,11b-三甲基-8-亚甲基十四氢-6a,9-甲基环庚a萘为萜类物质,中文名为贝壳杉烯是双萜类物质,它的对映体 ent-贝壳杉烯在贝壳杉烯合酶的作用下由反式-牻牛儿基牻牛儿焦磷酸开环而合成,是赤霉素的前体。雄花初开期到盛开期该物质含量发生下调,可能是由于雄花盛开期时所需赤霉素含量降低。棕榈醛为醛类物质,是脂肪酸生物降解释放出的代谢物,槟榔雄花初开期到盛开期花香释放量升高,同时棕榈醛的含量也发生上调,二者之间呈正相关关系。因此,以上 3 种代谢物可能是影响槟榔花香
5、的关键代谢物。关键词:代谢途径;代谢组学;槟榔花;差异代谢物 中图分类号:S792.91 文献标识码:A Screening of Key Metabolites of Areca Flower Fragrance Based on Non-targeted Metabonomics XIN Xiaodong,WEN Xinyu,JIANG Jiajun,WANG Ling,YANG Guobin,YANG Fusun*College of Tropical Crops,Hainan University,Haikou,Hainan 570228,China Abstract:In order
6、 to screen out the key metabolites that control the fragrance of areca nut,enhance the fragrance of areca nut,attract more pollinators,and then increase the yield of areca nut.In this study,Headspace Solid Phase Mi-croextraction Gas Chromatography-Mass Spectrometry Combined Analysis Technology was u
7、sed for non-targeted me-tabolomic detection of areca nut flowers in different periods.236 metabolites were detected in the study.75 differential metabolites were screened by combining VIP value and differential fold.Main metabolites were terpenes,ketones,al-cohols.Among them,the volatile compounds o
8、f female flowers of Areca accumulated a lot from the female flower un-opened stage to the initial blooming stage,and decreased slightly in the full bloom stage,so the initial blooming stage of female flowers of Areca may be the key period for the formation of female flower fragrance.The volatile com
9、pounds in 第 7 期 辛晓栋等:基于非靶向代谢组学的槟榔花香关键代谢物的筛选 1329 the male flowers of Areca accumulated a lot from the initial blooming stage to the blooming stage,so the blooming stage of male flowers may be the key period for the formation of flower fragrance of male flowers of Areca.KEGG database was used to anal
10、yze the metabolic pathways of differential metabolites.The fatty acid biosynthesis was the metabolic pathway that was significantly enriched in the female flowers of areca nut and related to flower aroma synthesis,and the substance enriched in this pathway was capric acid.Capric acid is a fatty acid
11、,which is mostly used in plant physiology and signal transmission and other functions.The capric acid content in the female flowers of betel nut increased from the unopened stage to the early flowering stage,and the release of floral fragrance also increased correspondingly.This may be because areca
12、 nut starts pollination at the beginning of female flower,and more chemical signals are needed to be transmitted to attract pollinators.So capric acid may be a chemical signal released by betel nut female flowers for pollination.Metabolic pathways significantly enriched in male areca nut flowers and
13、 related to flower aroma synthesis are diterpenoid biosynthesis and fatty acid degradation.Palmitaldehyde and(4aR,6aS,9R,11aR,11bR)-4,4,11b-trimethyl-8-methylene tetrahydro-6a and 9-methylcycloheptyl a naphthalene were enriched in two pathways.(4aR,6aS,9R,11aR,11bR)-4,4,11b-trimethyl-8-methylenetetr
14、ahydro-6a,9-methylcycloheptanaphthalene is a terpenoid.Its enantiomer,ent-kaurene,is synthesized by ring-opening of trans-geranylgeranyl pyrophosphate with the use of kaurine synthase and is a precursor ofgibberellin.The content of this substance was down-regulated from the early flowering period to
15、 the full bloom period of male flowers,which may be due to the decrease of the required gibberellin content in male flowers during the full bloom period.Palmitaldehyde is an aldehyde substance,which is a metabolite released by the biodegradation of fatty acids.The release of the fragrance of areca n
16、ut male flowers increased from the early blooming stage to the blooming stage,and the content of palmitaldehyde also increased.There is a positive correlation between these two situations.In conclusion,the above three metabolites may be the key metabolites that affect the fra-grance of areca nut.Key
17、words:metabolic pathway;metabolic;areca flowers;differential metabolites DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2023.07.003 槟榔(Areca catechu L.)属棕榈科槟榔属常绿乔木,是海南农户的主要收入来源1。槟榔属被子植物,其传粉方式分为自花传粉和异花传粉2 种类型。异花传粉主要分为风媒花与虫媒花,以风作为授粉媒介称为风媒花,风媒花颜色通常较为暗淡,气味不明显,同时不能产生花蜜,花粉粒较为干燥不具有黏着性,而且质量小容易被风传送。虫媒花指以昆虫为授粉媒介。虫媒花多具美丽花瓣、蜜腺和特
18、征香味,花粉具有黏着性容易附着在昆虫身体上的特点。槟榔雌雄花虽然同株同序,但雌雄花不同期开放,为异花授粉植物。由于槟榔授粉率较低,导致其产量低下。槟榔雌花颜色鲜艳、体型较大并有花香,雄花花粉质轻,易被风吹送,同时有大量香味溢出,前人认为槟榔为风媒花,但从表型分析发现槟榔花具有虫媒花特性,尤其槟榔雌雄花均有香味,且能产蜜。而花香作为一种化学信号有助于授粉者辨别植物的种类和位置2,具有吸引授粉者的功能。但由于槟榔花香味不足,吸引授粉者较少从而导致产量较低。代谢组学是一门新兴学科,可将样品信息进行有效整合,具有所需时间短、精度高和涵盖面广的特点,能够更加准确、全面地检测样品中的小分子代谢物3-5。其
19、中,非靶向代谢组学有助于更加全面地反映代谢物的变化,同时对于新的代谢通路的挖掘也有利6。固相微萃取(solidp phase mieroextraetion,SPME)技术是一种近年来新兴的处理技术,该技术对于食品香气分析意义重大7-9。目前对槟榔花的研究主要集中在其药用成分和特殊功效方面10-13。现有研究只对槟榔雄花与花梗的香气成分进行了初步分析,并未明确控制槟榔雌雄花花香的关键代谢物及其各时期的花香释放规律14。在植物中与花香有关的通路主要分为三大类,分别为萜烯类化合物的生物合成、苯丙烷/苯环类化合物的生物合成和脂肪酸衍生物的生物合成。因此本研究将采用顶空固相微萃取气相色谱质谱联合技术,
20、对不同时期的槟榔花进行代谢组学分析,明确槟榔花各时期的花香释放规律,同时筛选出与花香合成有关的通路,从而确定控制槟榔花花香的关键代谢物,为提升槟榔花香提供理论依据。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料 槟榔花于 2021 年 4 月 20 日至1330 热带作物学报 第 44 卷 7 月 20 日取于海南省琼中县槟榔园,经鉴定为海南本地品种。供试材料为雌花未开期(F1)、初开期(F2)、盛开期(F3),雄花初开期(M1)和盛开期(M2)共 5 个时期的槟榔花(图 1),每个时期 3 次重复。采集的样品送至迈维(武汉)生物科技有限公司进行代谢组学检测。图 1 不同时期的槟榔花 Fi
21、g.1 Areca flowers in different periods 1.1.2 主要仪器设备 本研究采用的仪器主要为安捷伦(Agilent)8890-5977B 型气相色谱-质谱联用仪、安捷伦(Agilent)DB-5MS 型色谱柱、安捷伦(Agilent)120 m DVB萃取头,均由安捷伦公司生产。1.2 方法 本研究主要参考 CHEN 等15和戴宇樵等16的实验方法,将所取样品使用液氮进行研磨,加入 NaCl 溶液,使用全自动顶空固相微萃取对样本进行萃取,以供 GC-MS 分析。色谱条件:DB-5MS 毛细管柱,恒流流速为1.0 mL/min,进样口温度为 250,不分流进样。
22、质谱条件:接口温度为 280,电子能量为70 eV,扫描范围为 50500 amu。1.3 数据处理 GC-MS 分析得到的原始数据先进行峰提取,获取特征峰的峰面积和保留时间等信息,然后采用迈维云平台和公共数据库对代谢物进行鉴定。根据差异系数(variable importance inproject,VIP1,P0.05)17和最大差异倍数值对检测到的代谢物进行筛选,同时对差异代谢物进行途径分析18。2 结果与分析 2.1 槟榔花中的挥发性有机化合物分析 通过 HS-SPMEGC/MS 方法,在不同时期的槟榔雌花、雄花中共鉴定出 236 种挥发性有机化合物,包括酯类、萜类、酸类等物质(图 2
23、)。其中酯类的种类最丰富(约 25%),其次为杂环化合物(约 15%)和萜类(约 15%)。在植物中杂环化合物一般对植物香味影响较小,但酯类物质与萜类物质的香气阈值较低对植物花香贡献很大,所以本研究认为这些挥发性有机化合物在促进槟榔花香气中起着非常重要的作用。图 2 槟榔雌花、雄花挥发性有机化合物分类 Fig.2 Classification of volatile organic compounds in male and female flowers of areca 2.2 不同时期槟榔花的代谢判别分析 2.2.1 主成分分析 对所得数据使用主成分分析,PCA 得分如图 3 所示。主成分
24、 1 的贡献率为45.47%,主成分 2 的贡献率为 12.97%。X 轴方向模型的累积解释率 R2X=0.751,因此该 PCA 模型拟合性较好。雄花 M1与 M2和雌花 F1、F2、F3基本分离,虽然 M1与雌花样本相距较近,可能是相同品种,代谢物种类相近导致的,但基本得到了有效区分,说明组间存在差异。图 3 槟榔雌花和雄花的 PCA 得分图 Fig.3 PCA scores of female and male flowers of areca 第 7 期 辛晓栋等:基于非靶向代谢组学的槟榔花香关键代谢物的筛选 1331 2.2.2 正交偏最小二乘判别分析 OPLS-DA 可以将与分类无
25、关的影响信息过滤掉,有助于对组间差异进行更加精确的区分。采用 OPLS-DA 对得到的质谱数据进行分析,发现槟榔雌花与雄花样品分布在置信区间的左侧和右侧,二者被明显区别,说明其存在显著差异,因此对槟榔雌雄花进行分类研究(图 4)。模型累计预测率 Q20.758,R2X=0.631,R2Y=0.992 说明该评估模型可靠有效(图 5)。图 4 槟榔雌花和雄花的 OPLS-DA 得分图 Fig.4 OPLS-DA scores of female and male flowers of areca 图 5 槟榔雌花和雄花的置换验证图 Fig.5 Verification diagram of re
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