金属卟啉重组蛋白的光活性与光稳定性研究.pdf
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1、第 37 卷第 3 期2023 年 6 月南华大学学报(自然科学版)Journal of University of South China(Science and Technology)Vol.37 No.3Jun.2023收稿日期:2022-12-08基金项目:国家自然科学基金项目(21701081);湖南省自然科学基金项目(2022JJ30485)作者简介:孔祥君(1996),男,硕士研究生,主要从事人工酶等方面的研究。E-mail:1332942395 。通信作者:杜可杰(1983),男,副教授,博士,主要从事人工酶催化等方面的研究。E-mail:DOI:10.19431/ki.167
2、3-0062.2023.03.010金属卟啉重组蛋白的光活性与光稳定性研究孔祥君,陈玉妹,林英武,杜可杰(南华大学 化学化工学院,湖南 衡阳 421001)摘 要:本研究以突变体肌红蛋白(myoglobin,Mb)F43H/H64A Mb 为骨架,通过原卟啉锌(zinc-protoporphyrin,ZnPP)、原卟啉钴(cobalt-protoporphyrin,CoPP)替代蛋白天然辅基血红素(heme)的方式制备了两个新的重组肌红蛋白(reconstituted myoglobin,rMb),命名为 ZnPP-F43H/H64A Mb 和 CoPP-F43H/H64AMb,并对其光稳定性
3、和光催化降解染料活性进行了研究。结果显示,ZnPP-F43H/H64A Mb 具备更好的光催化降解亚甲基蓝的能力,ZnPP-F43H/H64A 具有光不稳性。关键词:肌红蛋白重组;亚甲基蓝;光催化;光稳定性中图分类号:O641.4文献标志码:A文章编号:1673-0062(2023)03-0065-07Study on the Photoactivity and Photostability of MetalloporphyrinRecombinant ProteinKONG Xiangjun,CHEN Yumei,LIN Yingwu,DU Kejie(School of Chemistry
4、 and Chemical Engineering,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)Abstract:In this work,two reconstituted myoglobins(rMb),ZnPP-F43H/H64A Mb andCoPP-F43H/H64A Mb,were prepared by replacing the natural heme of F43H/H64A Mbwith zinc protoporphyrin(ZnPP)and cobalt protoporphyrin(CoPP).Thei
5、r photostabilityand photocatalytic activity for dye degradation were also studied.The results showed thatalthough ZnPP-F43H/H64A Mb has a certain ability of photocatalytic degradation of meth-ylene blue,it was also photounstable.key words:Reconstituted myoglobin;methylene blue;photocatalysis;photost
6、ability56第37 卷第3 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 6 月0 引 言近几十年来,伴随着有机染料在工业生产中的广泛应用,有机染料等工业化工原料废水的排放造成的污染已成为一个严重的全球环境问题1-2。据统计,全球每年约有 4.5105t 染料废水释放到水体中3,亚甲基蓝(methylene blue,MB)是其中常见的有机染料之一4。亚甲基蓝被广泛用于工业生产中棉花、羊毛、皮革和纸张的染色,这导致了大量未降解染料随废水排入河流、湖泊等水体,并在环境中的积累,对生态系统造成严重影响5-6。比如在水生态系统中,亚甲基蓝可影响光合作用,降低水体中溶解氧含量,致使生物需氧量和化学需
7、氧量增加,最终导致微生物群落异常7。有研究表明,该类染料废水会对人造成致癌、致畸和突变等不良影响8-9。因此,含亚甲基蓝染料的废水在排入环境前必须进行严格处理,达到排放标准方可排放。目前处理该类废水的方式主要有吸附、絮凝、过滤和膜分离等,但却存在能耗高、成本高、产生副产物(如污泥)、造成二次污染等不可忽视的缺陷10-11。相比之下,光催化降解具有经济、高效和环境友好等优点,比较适合从废水中充分去除有机染料,成为减少水污染物污染的有效方法之一12-13。关于降解染料废水的光催化剂研究目前主要集中在半导体材料如 TiO2和 CdS 材料14,还有一些 金 属 框 架 材 料(metal-organ
8、ic frameworks,MOF)也表现出了较好的光降解活性,但是金属材料在处理结束后会对水体造成二次污染15。寻找一种高效、无污染的染料降解试剂成为当务之急。金属蛋白酶因其具备高效、易分解等特点被广泛关注,但由于其对废水环境具有较大的敏感性,即在非中性条件下失活,而很难进行大规模推广应用16-17。Z.H.Shi 之前研究发现金属蛋白通过适当的改进(将锌卟啉与脱辅基肌红蛋白重组)后,具备较好的光催化核酸酶活性18。同时,由于 F43H/H64A Mb 的 64 位点组氨酸被丙氨酸替代而具有更大的催化活性,用其作为重组骨架,将其辅基血红素用锌卟啉(ZnPP)或者钴卟啉(CoPP)替换,得到了
9、两个新的重组蛋白(reconsti-tuted myoglobin,rMb),命名为 ZnPP-F43H/H64AMb 和 CoPP-F43H/H64A Mb,对其催化亚甲基蓝染料的活性进行了测试,实验结果显示,两个重组蛋白均显示了一定的光降解亚甲基蓝的能力。相同条件下 ZnPP-F43H/H64A Mb 比 CoPP-F43H/H64A Mb 具有更优秀的降解亚甲基蓝活性。值得注意的是,光照之后的 5 min 内,ZnPP-F43H/H64A Mb 在 427 nm 处的吸收峰的峰值出现明显下降,这说明该重组蛋白具有光不稳定性,在光照条件下其自身可以进行降解,这也为蛋白酶在发挥降解染料后的自
10、身处理(即催化剂后处理)提供了思路。1 实验部分1.1 试剂和仪器试剂:锌卟啉、钴卟啉(Sigma-aldrich,美国),亚甲基蓝(阿达玛斯,上海),2-丁酮(国药集团,上海)。其他所有化学试剂均为商业产品,实验所用试剂均为分析纯。仪器:紫外-可见分光光度计(UV-Vis,Aglient8453)、液相色谱-质 谱 联 用 仪(LC-MS,WatersXevo G2-XS QTof)等。1.2 突变体蛋白制备表征抹香鲸突变体肌红蛋白 F43H/H64A Mb 在大肠杆菌 BL(21)DE3 中表达并按照之前报道的方法进行纯化19-20。纯化后突变体蛋白样品的质谱数据在电喷雾电离质谱仪上测得。
11、1.3 重组蛋白制备及其紫外可见光谱研究脱辅基蛋白(apo-Mb)通过酸性丁酮法制得21,在含 apo-Mb 的磷酸钾缓冲液(100 mmol/L)中逐滴加入 ZnPP 的 DMSO 溶液。完全加入后,溶液搅拌一整夜,以确保达到平衡。在 4 下将溶液离心,去除未溶解的 ZnPP,然后浓缩至约6 mL。用 DEAE(diethylaminoethyl)柱在磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH=7.0)中预平衡,除去多余的 ZnPP。蛋白溶液在磷酸钾缓冲液(0.1 mmol/L,pH=7.0)中进行透析 24 h。最后收集浓缩。将重组蛋白储存在-20 供使用。用紫外-可见分光光度计(UV-Vi
12、s)检测重组蛋白特征峰,并计算蛋白浓度。锌卟啉重组蛋白的摩尔消光系数通过之前报道的方法测得22:551=12.3 L/(mmolcm)。CoPP-F43H/H64A Mb 的制备及浓度确定方法同上。1.4 亚甲基蓝光催化降解及重组蛋白光稳定性重组蛋白的光催化活性实验使用紫外可见分光光度计检测。通过 430 nm 的氙灯光源(60 W)对重组蛋白与亚甲基蓝的混合溶液光照不同时间后,检测亚甲基蓝溶液在 200 700 nm 范围内吸光度变化。CoPP-F43H/H64A Mb 的光照波长同为 430 nm,操作同上。重组蛋白光稳定性实验除66第37 卷第3 期孔祥君等:金属卟啉重组蛋白的光活性与光
13、稳定性研究2023 年 6 月了实验样品中不含亚甲基蓝外,其他操作同上。2 结果与讨论2.1 蛋白的纯化及表征突变体蛋白 F43H/H64A Mb 制备纯化后,使用紫外-可见光谱进行样品纯度检测,并通过质谱对其进行更直观的检测。结果显示实验测得的样品分子量为蛋白在质谱过程中电离脱掉血红素的分子量,数值为(17 255.5 0.5)Da(见图 1),与脱辅基蛋白计算值相吻合,可以确定突变蛋白是目标蛋白,并且纯度较好。F43H/H64A Mb 蛋白的紫外-可见光谱(见图 2(a)特征吸收峰为 407 nm,可以确定纯化所得蛋白即为目标蛋白 F43H/H64A,其 427 nm 处与 280 nm
14、处的峰比值为 4.2,说明蛋白纯度达到实验要求20。图 1 F43H/H64A Mb 质谱图:蛋白分子量的理论值 17 255 Da,实验值为(17 255.50.5)DaFig.1 Mass spectrum of F43H/H64A Mb:Calculated molecular weight of apo-protein,17 255 Da,Observed,(17 255.50.5)Da2.2 重组蛋白制备及其紫外-可见光谱研究采用酸性丁酮法制备 apo-F43H/H64A Mb,不难发现相较于 F43H/H64A Mb(图 2(a),apo-F43H/H64A 在407 nm、630
15、nm 处的最大吸收峰完全消失,仅 280 nm 最大吸收峰升高,表明蛋白的血红素辅基已经通过萃取去除完全。随后通过Apo-Mb 与金属卟啉重组获得重组蛋白,并通过紫外-可见 分 光 光 度 计 对 重 组 蛋 白 ZnPP-F43H/H64A Mb(图 2(b)和 CoPP-F43H/H64A Mb(图2(c)进行了表征。结果显示,对比于游离的金属卟啉,重组蛋白 ZnPP-F43H/H64A Mb 的主要吸收峰发生红移,最大吸收峰从 412 nm 红移到427 nm。重组蛋白 CoPP-F43H/H64A 最大吸收峰从 417 nm 红移到 426 nm。2.3 重组蛋白光催化降解亚甲基蓝活性
16、研究亚甲基蓝广泛用于纺织印染、药用染料等,含亚甲基蓝废水给环境治理带来很多影响,为解除亚甲基蓝对环境的影响,科学家不断寻找高效、无二次污染的亚甲基蓝降解材料5。为了研究重组蛋白酶是否具有催化降解亚甲基蓝的活性,以亚甲基蓝为底物,通过紫外-可见分光光度计研究了重组蛋白对亚甲基蓝的光催化降解能力,结果如图 3 所示。由图 3(a)可以发现,ZnPP-F43H/H64A Mb 在光照情况下,其紫外-可见光谱在665 nm 和 616 nm 处的吸收峰有明显的下降,这是亚甲基蓝在 600 700 nm 的两个主要吸收峰23,整体下降趋势较大,说明亚甲基蓝在该条件下产生降解。此外,可以观察到553 nm
17、 和594 nm 处吸收峰出现显著下降,该吸收峰是 ZnPP-F43H/H64A Mb 的特征吸收峰,在曝光120 300 s 后几乎消失,说明重组蛋白 ZnPP-F43H/H64A Mb 的二级结构发生了改变。在光照 120 300 s 后,亚甲基蓝降解开始趋于平缓,这与 ZnPP-F43H/H64AMb 的特征吸收峰消失时间上一致,说明了 ZnPP-76第37 卷第3 期南华大学学报(自然科学版)2023 年 6 月F43H/H64A Mb 的二级结构改变后逐渐失去亚甲基蓝降解活性。此外,另一个重组蛋白 CoPP-F43H/H64A Mb 的亚甲基蓝的降解活性实验结果显示,在同样的条件下,
18、没有显示出预期的亚甲基蓝的光催化降解活性(见图 3(b)。亚甲基蓝被不同蛋白酶催化后的降解率如图 3(c)所示。从结果中可以看到,在 ZnPP-F43H/H64A Mb 出现的情况下,亚甲基蓝才会产生一定的光降解,这说明该锌金属中心的人工蛋白具有一定的光活性,并可应用于染料的降解。2.4 ZnPP-F43H/H64A Mb 光稳定性研究在前面实验中显示,ZnPP-F43H/H64A Mb在 300 s 左右出现较大的二级结构稳定性降低和蛋白活性抑制,为了深入研究这一现象,对 ZnPP-F43H/H64A Mb 进行了光稳定性试验。结果如图4 所示。通过图4(a)可以发现 ZnPP-F43H/H
19、64AMb 在 427 nm 处的最大吸收峰随着曝光时间的增加快速下降并发生蓝移,在 60 s 内达到 38%的减色率,这说明重组蛋白内的 ZnPP 中心配位发生改变,ZnPP 从重组蛋白的中心配位点游离出来,这与之前的报道结果一致24。作为对照试验,金属中心为血红素的 F43H/H64A Mb 蛋白在光照下并没有发生减色效应,说明血红素与 F43H/H64A Mb 蛋白结合稳定,不会出现蛋白本身的光降解现象。该结果也说明了锌卟啉取代血红素后,尽管蛋白具有了一定的光催化降解亚甲基蓝的活性,但是由于其本身的光稳定性问题,导致其很快失活。图 2 磷酸钾缓冲液(100 mmol/L,pH=7.0)中
20、不同人工蛋白或金属卟啉的紫外-可见光谱图Fig.2 UV-Vis spectra of different myoglobin or metalloporphyrin in potassiumphosphate buffer(100 mmol/L,pH=7.0)86第37 卷第3 期孔祥君等:金属卟啉重组蛋白的光活性与光稳定性研究2023 年 6 月0:亚甲基蓝初始吸光度,:亚甲基蓝与不同催化剂反应一定时间后的吸光度图 3 不同时间光照下重组蛋白的亚甲基蓝降解活性实验(波长,430 nm)Fig.3 Methylene blue degradation activity of recombin
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