笼养急性应激下蛋鸭垂体microRNA的差异表达分析.pdf
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1、2023,45(4)DOI:10.13836/j.jjau.2023086江西农业大学学报 Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp:/笼养急性应激下蛋鸭垂体microRNA的差异表达分析张文韬1,2,刘水兵1,2,蒋红霞1,2,周明芳1,2,熊婷1,2,3,刘秋红1,2,胡晓龙1,2,毛辉荣1,2,刘三凤1,2,陈彪1,2*(1.江西农业大学 动物科学技术学院,江西 南昌330045;2.江西农业大学 家禽研究所,江西 南昌330045;3.江西生物科技职业学院,江西 南昌330200)摘要:【目的】研究基于microRNA(miRNA
2、)高通量测序技术鉴定蛋鸭在笼养急性应激情况下垂体miRNA的表达特性,旨在探索miRNA在应激情况下的潜在功能,为进一步探究龙岩山麻鸭在笼养过程中产生急性应激的分子机制提供参考。【方法】试验选取20只110 d龙岩山麻鸭,随机分组为笼养急性应激试验组(C组),即叠层笼上笼3 d状态下龙岩山麻鸭,和非应激对照组(FW组),即半舍饲散养龙岩山麻鸭;收集113 d时C组和FW组各4只龙岩山麻鸭垂体组织样品(C_P,FW_P),进行miRNA测序和分析。【结果】C_P和FW_P两组文库共检测到 331个已知的 miRNAs,预测了 5个新 miRNAs。差异分析结果显示,C_P组相对于 FW_P组有
3、8个 miRNAs显著差异表达(P0.05),其中4个miRNAs上调表达,4个miRNAs下调表达。差异表达miRNA的靶基因富集分析结果显示,靶基因极显著富集到钙信号通路(Calcium signaling pathway)、GnRH信号通路(GnRH signaling pathway)、孕酮介导的卵母细胞成熟(Progesteronemediated oocyte maturation)等信号通路上(P0.01)。【结论】笼养急性应激引起龙岩山麻鸭垂体组织中 hsa-miR-129-1-3p_1ss20TG、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-27a-3p_R-2、hsa-mi
4、R-99a-5p_R-1、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-15b-5p_R+1_2ss20AG21CT、PC-5p-1405_462、hsa-let-7f-1-3p_1ss22CT 8个 miRNAs 的差异表达,以上 miRNAs 可能通过调控多种信号通路调节龙岩山麻鸭的应激、生长、繁殖等生命活动。关键词:龙岩山麻鸭;笼养;应激;垂体;microRNA测序中图分类号:S834+.83 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号:1000-2286(2023)04-0931-13收稿日期:20230418 修回日期:20230515基金项目:国家自然科学基金项
5、目(32102541)、江西省自然科学基金项目(20212BAB215016)和江西省现代农业家禽产业技术体系(JXARS-09)Project supported by the National Natural Science Foundation of China(32102541),the Natural Science Foundation of Jiangxi Province(20212BAB215016)and the Technology System of Modern Agricultural Poultry Industry of Jiangxi Province(JXA
6、RS-09)作者简介:张文韬,硕士生,orcid.org/0009-0000-3299-6963,;*通信作者:陈彪,副教授,博士,主要从事家禽遗传育种与生产研究,orcid.org/0000-0003-1852-5289,。张文韬,刘水兵,蒋红霞,等.笼养急性应激下蛋鸭垂体microRNA的差异表达分析 J.江西农业大学学报,2023,45(4):931-943.ZHANG W T,LIU S B,JIANG H X,et al.MicroRNA differential expression in egg duck pituitary gland under acute stress in
7、 cage-rearingJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(4):931-943.江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷MicroRNA Differential Expression in Egg Duck Pituitary Gland Under Acute Stress in Cage-rearingZHANG Wentao1,2,LIU Shuibing1,2,JIANG Hongxia1,2,ZHOU Mingfang1,2,XIONG Ting1,2,3,LIU Qiuhong1,2,HU Xiaol
8、ong1,2,MAO Huirong1,2,LIU Sanfeng1,2,CHEN Biao1,2*(1.College of Animal Science and Technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.Poultry Research Institute,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;3.Jiangxi Biotech Vocational College,Nanchang 330200,China)Abstract:O
9、bjective Based on the high-throughput sequencing technology of microRNA(miRNA),this study aims to identify the expression characteristics of pituitary miRNA in egg-laying ducks under acute stress in cage and explore the potential function of miRNA under stress,thus providing a reference for further
10、exploring the molecular mechanism of acute stress in Longyanshan hemp ducks during cage rearing.MethodIn this study,twenty 110-day-old Longyan shan hemp ducks were chosen.The ducks were randomly assigned into two groups:cage-reared(C group,n=10),which was subjected to a stacked cage system for three
11、 consecutive days,and free-range non-stressed group(FW group,n=10),which was raised under semi-houseing conditions.At 113 days of rearing,four pituitary tissue samples were collected from each group(C_P,FW_P)for miRNA sequencing and analysis.Result A total of 331 known miRNAs were detected in the C_
12、P and FW_P libraries,and 5 new miRNAs were predicted.Differential analysis revealed eight significantly differentially expressed miRNAs in C_P vs FW_P(P0.05),with four miRNAs upregulated and four miRNAs downregulated.Enrichment analysis of target genes indicated significant enrichment in calcium sig
13、naling pathway,gonadotropin-releasing hormone signaling pathway(GnRH signaling pathway),progesterone-mediated oocyte maturation and other signaling pathways(P0.01).ConclusionThese results suggest that acute stress in cages leads to differential expression of hsa-miR-129-1-3p_1ss20TG,hsa-let-7c-5p,hs
14、a-miR-27a-3p_R-2,hsa-miR-99a-5p_R-1,hsa-let-7b-5p,hsa-miR-15b-5p_R+1_2ss20AG21CT,PC-5p-1405_462,hsa-let-7f-1-3p_1ss22CT miRNAs in pituitary tissue,which may regulate stress,growth,reproduction,and other life activities of Longyan shan hemp ducks through various signaling pathways.Keywords:Longyan sh
15、an hemp duck;cage rearing;stress reponse;pituitary;microRNA sequencing【研究意义】我国养鸭历史悠久,2021年我国鸭存栏量仍居世界第一。随着社会发展和农业科技的进步,传统蛋鸭养殖模式已不适应我国以绿色、健康、环保为主题的规模化、集约化产业发展需求。蛋鸭养殖模式逐渐从小规模散养向大规模集约化养殖转变且快速发展。笼养模式作为近年来兴起的新型蛋鸭养殖模式,发展前景良好1-2。笼养模式下饲养蛋鸭,有利于促进蛋鸭饲养科学化、标准化发展,提高生物安全和产品品质,节约生产成本,提高生产效率。蛋鸭在笼养模式下取得了优异的生产性能和人工授精效
16、果3-6,但将蛋鸭由散养转为笼养模式的过程中会产生应激反应。应激反应可能会导致鸭生长缓慢、产蛋率偏低、体表羽毛不齐等问题,严重制约了蛋鸭笼养技术的推广普及7。【前人研究进展】蛋鸭本身具有耐寒不耐热、体温高、代谢旺盛、皮肤无汗腺分布、难散热等生理特点。在笼养模式下,蛋鸭机体产生的热量使环境温度升高,易造成蛋鸭热应激,从而影响其生产性能5。饲养密度也是引起家禽应激的因素之一。大量研究发现,高密度饲养可能会导致家禽发生应激,从而降低家禽生产性能9-10。此外,养殖过程中的各种刺激,如氨气、硫化氢等生物应激因素,均可导致家禽应激11-12。应激是指机体受到各种因 932第 4 期张文韬等:笼养急性应激
17、下蛋鸭垂体microRNA的差异表达分析素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应,是家禽常见的生理或病理反应13。将蛋鸭由散养转为笼养模式的过程中产生的应激反应在上笼初期尤为明显,Zhang等14在绍兴蛋鸭笼养早期机体抗氧化和炎症损伤的研究中通过组织病理学分析发现,相较于散养组经过1,2 d的笼养应激组鸭肝脏表现出严重的损伤、炎症浸润和血细胞渗出,4 d后肝损伤开始好转,这些结果表明,在笼养早期应激期,短期应激刺激足以对机体组织造成应激损伤。Zheng等15采用液相色谱串联质谱法测定传统饲养和笼养5,10,15 d后鸭血浆中代谢物的变化,分析了笼养应激对鸭生产性能参数和氧化应激指标的影响,推断笼
18、养应激组鸭在笼养后的前5 d处于敏感期。本课题组前期比较了笼养蛋鸭和平养蛋鸭上笼3 d后血浆非靶代谢组学的异同,探究了急性笼养应激对蛋鸭代谢的影响,通过分析发现,笼养急性应激会导致蛋鸭血浆中甘油磷脂代谢途径紊乱,蛋鸭在笼养条件下机体代谢发生适应性变化16。以上研究结果均表明笼养应激影响蛋鸭生长发育等生命活动。应激通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)刺激机体做出相应应激反应17。垂体在应激反应的调节中通过内分泌系统发挥重要作用18。【本研究切入点】关于家禽特别是蛋鸭应激的研究多集中于表观性能,其作用机制还需系统性研究。随着科
19、学技术的发展,组学技术在动物生产上的应用逐渐普及,可利用组学技术研究蛋鸭在笼养过程发生应激的具体调控机制。microRNA(miRNA)是一类长度为2024 nt的具有调控功能的非编码RNA,主要通过与靶基因mRNA的3UTR结合的方式,介导mRNA的翻译抑制19。miRNA参与各种各样的细胞活动和生物过程,例如细胞增殖和代谢、生长发育、病毒防御、癌症等20-22。【拟解决的关键问题】本研究拟以龙岩山麻鸭作为研究对象,笼养作为应激源,从垂体miRNA表达水平的角度,探究笼养模式下蛋鸭应激发生的分子机制。1 材料与方法1.1试验动物与分组选取110 d半舍饲散养、体格均一的龙岩山麻鸭20只(江西
20、天韵农业开发有限公司,南昌),随机分为叠层笼饲养组即笼养急性应激组(cage-rearing system,C组,试验组)和半舍饲散养组即非应激组(floor-water combination system,FW组,对照组),每组10个个体。C组在110 d时转移到叠层笼中饲养,上笼3 d后即113 d后随机选取C组和FW组龙岩山麻鸭各4只作为试验对象,分别取垂体组织液氮速冻后-80 保存备用。将叠层笼饲养急性应激组垂体命名为C_P(试验组),半舍饲散养非应激组垂体命名为FW_P(对照组)。1.2试验方法与步骤1.2.1RNA提取和文库构建采用TruSeq Small RNA Sample
21、Prep Kits因美纳(中国)科学器材有限公司试剂盒提取RNA,制备小RNA测序文库。分别提取垂体样品总RNA,经质检合格后,在小RNA 3、5连接接头并反转录成cDNA,经PCR扩增建立小RNA测序文库。文库经长度检测后用于测序和生物信息学分析。1.2.2miRNA测序分析使用Illumina Hiseq 2500单端150 bp测序模式对构建的文库进行高通量测序,再用ACGT101-miR(杭州联川生物技术股份有限公司)对miRNA数据进行分析参照Bi等23方法,首先去除3接头和无效序列,获取clean data,并对其进行长度筛选(保留碱基长度在1826 nt的序列);随后进行RNA数
22、据库不包含miRNA(mRNA、RFam和Repbase)比对分析和过滤得到Valid数据;将有效数据比对到前体和基因组(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2793?genome_assembly_id=426073)进行miRNA鉴定、预测和命名;以P0.05为阈值进行差异表达miRNA的筛选;使用TargetScan(v5.0)、miRanda(v3.3a)两款软件分别对显著性差异的miRNA进行靶基因预测,最后取此两款软件预测结果的交集作为差异miRNA的最终靶基因。1.2.3差异性miRNA靶基因富集性分析对差异表达的miRNA靶基因进行GO和KEG
23、G富集分析,参考Bi等23方法,将靶基因向GO和KEGG数据库映射,将这些基因按照对应的GO和KEGG条目进行注 933江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷释,计算每个条目和通路的差异基因数,然后应用超几何检验找出与整个基因组背景相比显著富集的GO条目和KEGG通路,并对结果进行可视化绘图。1.2.4miRNA 及靶基因实时荧光定量 PCR 验证分析采用 miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将总 RNA 中的 miRNA 进行反转录,合成 cDNA 第 一 链。has-let-7c-5p
24、(TGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT)、hsa-miR-99a-5p_R-1(AACCCGTAGATCCGATCTTGT)、hsa-let-7b-5p(TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT)、hsa-miR-129-1-3p_1ss20TG(AAGCCCTTACCCCAAAAAGGAT)4 个 miRNAs 均由锐博生物(广州锐博生物技术有限公司)设计特异性的 Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR 引物组(每组包含一个反转录引物和一对定量引物),以 U6 为内参基因,按照 miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物
25、科技股份有限公司)配制反应体系:每个 10 L 的 qPCR 混合物含有 5 L 的 2miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、0.2 L 的反向引物(10 mol/L)、0.2 L 的正向引物(10 mol/L)、2 L 的 cDNA 和 2.6 L 的不含核糖核酸酶的ddH2O。在Applied Biosystems QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统赛默飞世尔(中国)有限公司按照:初始变性(95 15 min);40个循环的扩增(95 10 s和60 30 s);热变性(95 15 s,60 60 s,95 15 s)产生熔解曲线的条件进行
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