苦荞糖基转移酶基因FtUGT143的克隆及表达分析.pdf
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1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):204-212收稿日期:2023-02-08基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK2021重点 035),国家自然科学基金项目(31701494,32260461),国家燕麦荞麦现代农业产业技术体系专项资金(CARS-07-A5)作者简介:王佳蕊,女,硕士研究生,研究方向:荞麦分子生物学;E-mail:通讯作者:李洪有,男,博士,教授,研究方向:荞麦分子育种;E-mail:苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析王佳蕊1,2 孙培媛1,2 柯瑾1,2 冉彬1,2 李洪有1(1.贵州师范大
2、学荞麦产业技术研究中心,贵阳 550001;2.贵州师范大学生命科学学院,贵阳 550025)摘 要:苦荞Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn富含类黄酮 C-糖苷,具有抗氧化、抗癌和消炎等多种保健作用。通过RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)技术从苦荞中克隆得到了一个糖基转移酶基因,命名为 FtUGT143,对其进行生物信息学、分子对接、基因表达、基因表达量与代谢物含量相关性等分析。结果表明,FtUGT143 全长 CDS 序列为 678 bp,编码 226 个氨基酸。密码子偏好分析结果显示,FtU
3、GT143 具有双子叶植物的密码子使用偏好性。多序列比对和进化树分析表明,FtUGT143是植物糖基转移酶基因家族中的C-糖基转移酶亚家族成员。分子对接结果表明,FtUGT143能与合成黄酮C-糖苷(牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素)的底物芹菜素和木犀草素相互作用。RT-qPCR 结果显示,FtUGT143 基因在苦荞的各个组织部位中均有表达,但在芽苗期的根、茎、叶中显著表达,且其在不同组织部位的表达量与 4 种黄酮 C-糖苷积累量具有较好的相关性。研究结果表明 FtUGT143 是 C-糖基转移酶,它可能参与苦荞中黄酮 C-糖苷生物合成,对于揭示苦荞中黄酮 C-糖苷的合成机制具有重要意义。
4、关键词:苦荞;C-糖基转移酶;黄酮 C-糖苷;基因克隆;分子对接;FtUGT143;表达分析DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0098Cloning and Expression Analyses of C-glycosyltransferase Gene FtUGT143 in Fagopyrum tataricumWANG Jia-rui1,2 SUN Pei-yuan1,2 KE Jin1,2 RAN Bin1,2 LI Hong-you1(1.Research Center of Buckwheat Industry Technology,G
5、uizhou Normal University,Guiyang 550001;2.School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550025)Abstract:Tartary buckwheatFagopyrum tataricum(L.)Gaertnis rich in flavonoid C-glycosides,and it has many health effects,such as anti-oxidation,anti-cancer and anti-inflammation.In this study,in
6、 order to explore the flavonoid C-glycosyltransferase gene in tartary buckwheat,a glycosyltransferase gene named FtUGT143 was cloned from tartary buckwheat by RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction),and its bioinformatics,molecular docking,gene expression,correlation between gene exp
7、ression and metabolites content were also analyzed.The results showed that the full-length CDS sequence of FtUGT143 was 678 bp,encoding a protein of 226 amino acids.The codon preference analysis indicated that FtUGT143 had the codon usage preference of dicotyledons.Multiple sequence alignment and ph
8、ylogenetic tree analysis suggested that FtUGT143 belonged to the carbon glycosyltransferase subfamily of plant glycosyltransferase gene family.The molecular docking analysis implied that FtUGT143 interacted with apigenin and luteolin,which were the substrates of flavonoid C-glycosides(vitexin,isovit
9、exin,orientin and isoorientin).RT-qPCR results showed that FtUGT143 gene was expressed in all tissues of tartary buckwheat,but it was significantly expressed in the roots,stems and leaves at seedling stage,and its expression in different tissues had a good correlation with the accumulation of four f
10、lavonoid glycosides.The research results showed that FtUGT143 is a C-glycosyltransferase which may participate in the biosynthesis of flavonoid C-glycosides,revealing the important role of FtUGT143 in the synthesis mechanism of flavonoid C-glycosides in tartary buckwheat.Key words:tartary buckwheat;
11、C-glycosyltransferase;flavonoid C-glycosides;gene cloning;molecular docking;FtUGT143;expression analyses2023,39(8)205王佳蕊等:苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析类黄酮化合物是一类广泛存在于植物中的次生代谢物,在植物生长发育、生物与非生物胁迫抵抗中起着至关重要的作用1-2。此外,类黄酮化合物还具有降“三高”、消炎、抗氧化、抗病毒、抗动脉硬化、抗糖尿病、抗癌防癌等多种保健功能3-4。根据化学结构差异,将类黄酮化合物分为黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇和花青素
12、六大类5。在植物中,大多数类黄酮化合物以糖苷类化合物形式存在。通常,植物中类黄酮化合物的糖基化由糖基转移酶催化完成,糖基化的位置主要发生在 3-O位或 7-O 位,少部分也发生在 5-O 位和 4-O 位。此外,还有少部分类黄酮化合物直接在苯环上的 6-C位或 8-C 位发生糖基化,这类化合物称为类黄酮 C-糖苷5。目前,植物中已报道的类黄酮 C-糖苷主要有牡荆素(芹菜素-8-C-葡萄糖苷)、异牡荆素(芹菜素-6-C-葡萄糖苷)、荭草素(木犀草素-8-C-葡萄糖苷)、异荭草素(木犀草素-6-C-葡萄糖苷)等6。它们在植物中具有较强的生物活性,不易水解,对植物生长和发育、非生物和生物胁迫的响应以
13、及环境防御等发挥的作用7。在植物中,类黄酮 C-糖苷的生物合成主要是在 C-糖基转移酶的催化作用下,直接将糖基供体转移到底物黄酮的苯环骨架的 C 上。目前,在植物中已有多个 C-糖基转移酶被鉴定6。He 等8在金莲花(Trollius chinensis Bunge)中鉴定到的 C-糖基转移酶 TcCGT1,可以特异性地催化黄酮类、黄酮醇等黄酮类化合物的 8-C 糖基化黄酮类化合物。Wang 等9在大豆(Glycine max(Linn)Merr.)毛状根中过表达葛根(Pueraria montana var.lobata)的 PIUGT43,发现其编码蛋白酶具有将大豆苷元催化为葛根素的活性,
14、且对异黄酮具有底物专 一 性。Mashima 等10将 山 葵(Wasabia japonica(Miq.)Matsum.)的 WjGT1 在大肠杆菌中重组表达发现,该酶可将芹菜素或木犀草素催化合成异牡荆苷或异荭草苷。Brazier-Hicks 等11发现水稻(Oryza sativa L.)OsCGT 可通过与脱水酶协同作用催化 2-羟基黄酮合成黄酮 C-糖苷。在甜荞(Fagopyrum esculentum moench)的研究中发现,糖基转移酶FeCGTa 和 FeCGTb 均以 2-OH 黄烷酮为底物催化生成黄酮 C-糖苷12。苦荞(Fagopyrum tataricum Gaertn
15、)属于蓼科荞麦属,是起源于我国西南地区的一年生小杂粮作物,含有丰富的高活性类黄酮化合物(1.0%-3.0%),具有较高的保健作用3-4。目前,在苦荞种子中已鉴定到 90 余种类黄酮化合物,其中一半以上为黄酮糖苷类化合物,包括类黄酮 C-糖苷中的牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素等3。在苦荞中,目前已有多个糖基转移酶被功能鉴定催化了黄酮糖苷的合成13-17,但未见参与类黄酮 C-糖苷生物合成的C-糖苷糖基转移酶基因的相关报道。课题组前期对苦荞糖基转移酶基因家族进行系统鉴定,通过系统进化分析发现候选基因与已鉴定功能的 C-糖基转移酶聚在一支(数据未发表)。本研究利用 RT-PCR 技术,从苦荞品种
16、品苦 1 号中克隆一个可能参与苦荞类黄酮 C-糖苷生物合成的 C-糖基转移酶基因FtUGT143,并对其进行生物信息学、系统进化、分子对接、基因表达、基因表达量与类黄酮 C-糖苷含量关系分析,以期为苦荞类黄酮 C-糖苷生物合成中的功能研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料 苦荞品种品苦 1 号,由山西农业大学提供。1.1.2 载体 pMD19-T,购自大连宝日医生物公司。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 RNA 提取 RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒提取 品苦 1 号 芽苗期的根、茎、叶,
17、6 叶期植株的根、茎、叶,成年期植株的花、种子的总 RNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。1.2.2 cDNA(complementary DNA)获取 以叶片的 总 RNA 为 模 板,PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒进行反转录,用于基因全长 CDS 序列克隆的第一链 cDNA。根据 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒说明书,分别以品苦 1 号芽苗期的根、茎、叶,6 叶期植株的根、茎、叶,成年植株的花、种子的总 RNA 为模板,合生物技术通报 Biotechn
18、ology Bulletin2023,Vol.39,No.8206成用于荧光定量的第一链 cDNA。1.2.3 FtUGT143 全长 CDS 的克隆 根据已知苦荞基因组数据中注释的 FtUGT143 的核酸序列,BioXM 2.7 和 DNMAN 软件设计扩增目的基因片段全长的CDS 序列的特异性引物 FtUGT143-F 和 FtUGT143-R(表 1),以 1.2.2 中叶 cDNA 为模板,高保真 KOD酶进行 PCR 扩增。PCR 产物加 A 尾反应后,经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收、连接目的产物、连接 pMD19-T 载体、转化大肠杆菌感受态 DH5。PCR 检测阳性菌
19、株后,送至上海生工生物工程股份表 1 本研究中所用引物序列Table 1 List of primerssequences in this study引物名称 Primer name引物序列 Primer sequence(5-3)用途 UseFtUGT143-FATGGACTGGATGGATGAGATGCTA基因克隆 Gene cloningFtUGT143-RCTGTCAAATTTCGACACTGTCAAG基因克隆 Gene cloningqFtUGT143-FTAAGGAGATGGCTGAAGCTG荧光定量 Fluorescent quantificationqFtUGT143-RCAC
20、CGAACTTGGATATCCGA荧光定量 Fluorescent quantificationqFtUPL7-FTTCACGGGCACCATTACTGG荧光定量内参 Fluorescent quantification of internal reference primersqFtUPL7-RAGGTGGAAGCTGAAGGAAGC荧光定量内参 Fluorescent quantification of internal reference primers有限公司测序。1.2.4 FtUGT143 的生物信息学分析 CodonW 1.4.2对 FtUGT143 基因密码子偏好性参数分析;B
21、ioXM 2.7查询其最大开放阅读框(open reading frame,ORF),预测其编码的蛋白序列及编码蛋白的等电点和分子量大小;NCBI 中的 BLAST 比对查找 FtUGT143 蛋白的同源蛋白,DNAMAN 进行蛋白序列多序列比对;MEGA 7.0 软件采用 NJ 法构建 FtUGT143 与其他已知的植物黄酮糖基转移酶基因构建系统进化树;AutoDock Vina 1.1.2 对 FtUGT143 与 4 种类黄酮代谢小分子进行分子对接模拟实验,Pymol 2.4.0 可视化分析对接结果。1.2.5 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达分析 BioXM 2.7 软件和
22、 DNAMAN 软件分析设计FtUGT143 的实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR)引 物 qFtUGT143-F 和 qFtUGT143-R,设计内参基因 FtUPL7 的荧光定量引物 qFtUPL7-F 和qFtUPL7-R(表 1),以 1.2.1 中品苦 1 号芽苗期的根、茎、叶,6 叶期植株的根、茎、叶,成年植株的花、种子的总 RNA 为模板,苦荞的 FtUPL7 作为内参基因,SYBR Premix Ex TaqTM II 试剂盒进行荧光定量分析,伯乐 bio-rad 实时定量 PCR 仪 CFX96扩增,每个样本设置3个生物学重复和3个技术
23、重复。2-Ct法计算基因的相对表达情况。具体操作参照Li 等18的方法进行。参照王璐瑗等19方法提取和测定各组织部位中总黄酮含量。GraphPad Prism 9.0分析 FtUGT143 在苦荞不同组织部位中的表达量与总黄酮含量间相关性。2 结果2.1 FtUGT143全长CDS的克隆及其编码蛋白特征分析以品苦 1 号叶片 cDNA 为模板,基因特异性引物 FtUGT143-F 和 FtUGT143-R 扩增出一条约 700 bp 的目的条带(图 1)。目的条带经测序比对,发现其与参照序列完全一致,CDS 全长为678 bp,编码 226 个氨基酸。Protparam 在线软件对FtUGT1
24、43 进行分析,结果显示,相对分子质量为25.16 kD,理论等电点为 4.76,是稳定的疏水蛋白。M:DNA maker 2000;1:FtUGT143 的扩增片段M:DNA maker 2000.1:Amplified fragment of FtUGT143图 1 苦荞 FtUGT143 基因全长 CDS 克隆Fig.1 Full-length CDS clone of the FtUGT143 gene of buckwheat(Fagopyrum tataricum)2023,39(8)207王佳蕊等:苦荞糖基转移酶基因 FtUGT143 的克隆及表达分析2.2 FtUGT143的生
25、物信息学分析2.2.1 FtUGT143 的密码子偏好分析 Codon W 分析FtUGT143 基因序列的密码子偏好性,其序列的有效密码子数(ENC 值:范围 20-61)为 51.17,表明FtUGT143 的密码子偏好性较弱;密码子适应指数(CAI 值:范围 0-1)为 0.157 4,进一步表明该基因的密码子偏好性较弱。FtUGT143 的 GC 与 GC3s 含量均小于50%,该ORF序列中GC含量小于AT含量,说明苦荞的糖基转移酶基因在编码时偏好使用 A 或T 结尾的密码子。对 FtUGT143 密码子 RSCU 值分析(图 2),其中有 26 个密码子的 RSCU 值大于 1,是
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