金属盐强化乙醇预处理和添加剂联合对杨木酶解的影响.pdf
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1、金属盐强化乙醇预处理和添加剂联合对杨木酶解的影响朱光辉1,黄心宇1,毛翠平2,谢君1,张红丹1(1.华南农业大学生物质工程研究院,广州510642;2.山东天成工程咨询有限公司,潍坊261100)摘要:农林废弃物的生化转化是木质纤维类生物质能源化利用的重要手段之一。其中,木质纤维素是生物质能源最重要的形式,通过生化转化将木质纤维素转化为可发酵糖,进而转化为燃料乙醇和化学品,是生物炼制的重要途径之一。该研究以杨木为研究对象,采用不同金属盐强化的乙醇溶液对杨木进行预处理,探究不同金属盐(FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2NaCl 和 Li
2、Cl)强化乙醇预处理对杨木组分和酶解效果的影响,同时在酶解段进行不同种类添加剂(吐温 80、茶皂素、牛血清白蛋白和木聚糖酶)的添加,探究不同金属盐强化乙醇预处理和不同添加剂联合对杨木酶解效率的影响,从而得到杨木酶解最优的金属氯化物和添加剂组合。结果表明:金属盐强化乙醇预处理能显著去除半纤维素和木素,破坏杨木原料的致密结构,提升预处理底物中纤维素含量,暴露更多可接触位点,提高酶对纤维素的可及性,其中三价和部分二价金属盐(过渡金属盐)强化乙醇预处理能一定程度地提升酶解效果,获得较高的葡萄糖得率。添加剂的加入可不同程度的提升酶解速度、缩短酶解时间,并提升预处理样品的最终葡萄糖得率,其中在吐温 80
3、的作用下,FeCl3强化的乙醇预处理后杨木酶解可获最高葡萄糖得率达 93.44%,该研究结果可为农林废弃物利用提供参考。关键词:酶解;预处理;杨木;金属盐;添加剂doi:10.11975/j.issn.1002-6819.202305006中图分类号:TK6;S21文献标志码:A文章编号:1002-6819(2023)-12-0197-09朱光辉,黄心宇,毛翠平,等.金属盐强化乙醇预处理和添加剂联合对杨木酶解的影响J.农业工程学报,2023,39(12):197-205.doi:10.11975/j.issn.1002-6819.202305006http:/www.tcsae.orgZHUG
4、uanghui,HUANGXinyu,MAOCuiping,etal.Effectsofdifferentmetal-saltscatalyzedethanolpretreatmentandadditives on the enzymatic hydrolysis of poplarJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(TransactionsoftheCSAE),2023,39(12):197-205.(inChinesewithEnglishabstract)doi:10.11975/j.issn
5、.1002-6819.202305006http:/www.tcsae.org0引言能源危机、环境污染和温室效应使得人们迫切地需要寻找一种可以替代石化能源的可再生资源。生物质能源由植物体通过光合作用所得到,其储量巨大、来源方便、可再生,可以直接转化为化学品和液体燃料,其中,木质纤维素是生物质能源最主要的存在形式,通过生化转化的手段将木质纤维素转变成可发酵糖,并进一步转化为燃料乙醇和化学品是生物炼制的重要途径之一,从而受到了各国广泛的关注和研究1。杨木作为一种速生丰产树种,是一种极具潜力的生物质能源,它主要由纤维素、半纤维素和木素组成,它们相互连接,形成一种致密的抗降解屏障,这种结构将影响纤维素
6、酶对杨木的可及性,从而影响酶解效率,进而增加纤维素乙醇的生产成本,因此预处理是将林木生物质转化为燃料乙醇的最重要一步2。有机溶剂预处理是指采用有机溶剂或其水溶液在100250 下去除木质纤维原料中的木素和/或半纤维素3,有机溶剂乙醇因其可回收、低毒和低成本的优点而被广泛应用于预处理过程中,然而仅靠半纤维素中乙酰基的脱落所形成的乙酸来催化乙醇预处理以降解木素和半纤维素是不够的,因此需要在预处理过程中添加酸性催化剂以提高其酶解效率4。金属盐预处理因能实现木质纤维素组分的有效分离,达到传统酸预处理效果的同时还可规避对设备腐蚀等缺点5-6,正逐渐替代传统无机酸作为催化剂用于生物质原料的预处理。其作为催
7、化剂进行预处理能有效水解半纤维素组分,原因在于酸性金属盐溶于水后生成的水合氢离子能有效破坏木质纤维素的紧密结构,并产生更易被酶水解的固体残留物7,此外,路易斯酸中某些特定的离子对酶活性有积极影响8。有机溶剂预处理和金属盐预处理的联用(即金属盐强化的有机溶剂预处理)能够在大量地去除木质素和半纤维素的情况下,保持较高的催化效率。ZHANG 等9通过对比未处理的和分别经过 FeCl3、CuCl2、AlCl3强化乙醇预处理后的巴沙木的酶解效率,发现预处理后样品的糖得率在 81.54%85.81%,远高于未处理的巴沙木直接酶解的葡萄糖得率 9.98%。HAN 等10在 CuCl2强化的乙醇预处理后杨木酶
8、解过程中进行茶皂素的添加,葡萄糖和木糖得率分别达到 97.96%和 87.1%。综合以上研究报道,虽然对金属盐强化有机溶剂预处理和表面添加剂联用能够促进木质纤维素的酶解效率,但对不同金属盐强化有机溶剂预处理与不同种类添加剂联用的作用效果及其机制不清楚。收稿日期:2023-05-04修订日期:2023-06-20基金项目:国家重点研发计划(2021YFC2101603)和国家自然科学基金项目(21978108)联合支持作者简介:朱光辉,研究方向为生物质原料预处理与酶解。Email:通信作者:张红丹,博士,副研究员,研究方向为生物质的高效转化与利用。Email:第39卷第12期农 业 工 程 学
9、报 Vol.39No.122023年6月TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineeringJune2023197本研究旨在探究不同金属盐强化乙醇预处理对杨木化学组成、预处理液糖成分、微观物理结构和酶解葡萄糖产率的影响,分析酶解阶段不同种类阶添加剂(吐温80、茶皂素、BSA、木聚糖酶)的添加对杨木酶解葡萄糖得率和增长率的影响,以期为进一步揭示金属盐强化乙醇预处理联合添加剂对杨木酶解促进效果的影响机理提供一定的理论指导。1材料与方法1.1试验材料本研究中使用的杨木约 0.50.1mm,意大利杨,生长于河南,由华南农业大学木材加工厂提供,
10、在室温下用密封袋保存。杨木原料的化学成分含量根据美国国家可再生能源实验室提出的方法进行测定11,其中纤维素的质量分数为 45.56%、半纤维素的质量分数为 14.98%、酸不溶木素的质量分数为 22.86%、酸溶木素的质量分数为 3.31%。无水乙醇(分析纯),购于中国国药集团化学试剂有限公司。吐温 80(化学纯),购于科密欧化学试剂有限公司。牛血清白蛋白(化学纯),购于伯奥生物科技有限公司。茶皂素(纯度95%)和木聚糖酶(100000U/mg),皆购于上海麦克林生化科技有限公司。赛力二代纤维素酶,购于诺维信中国生物技术公司,采用 DNS 方法测得其滤纸酶活为 138FPU/mL,于 4 冰箱
11、中保存。FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl、LiCl、乙酸和乙酸钠等化学药品,皆为分析纯,购于上海麦克林生化科技有限公司。1.2金属盐强化乙醇预处理准确称量 15g 绝干杨木于 300mL 的高压反应釜(Parr-4500,美国 Parr 公司)中,加入 150mL60%(体积比)的乙醇溶液,使其固液比为 1:10,加入相当于0.025mol/L 的金属盐(FeCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、NaCl 和 LiCl),充分搅拌均匀后,盖紧密封盖,套上加热套,设置转速
12、为 300r/min,在 200 下持续反应 10min12。当试验温度达到预定温度时开始计时,反应结束后立即停止加热,拆下加热套,用流动水将其冷却至室温,然后进行真空抽滤分离预处理液体和残渣,收集部分预处理液以测预处理液中的单糖和低聚糖。收集剩下的预处理残渣,用自来水和去离子水充分洗涤至中性后,装入密封袋,放入 4 冰箱中平衡水分,然后称取少量预处理样品进行水分含量测定,计算预处理后杨木的固体残留率。1.3预处理样品的酶解准确称取相当于 2g 不同金属盐强化乙醇预处理绝干样品,分别加入含有 100mLpH 值为 4.8 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.05mol/L)的 150mL 锥形瓶中,其
13、固液比为 2%,加入 15FPU/g 干物质的纤维素酶,混合均匀后放于 50、150r/min 的摇床中进行酶解,并在酶解时间为 6、12、24、48 和 72h 时,分别取 0.5mL 上清液,沸水浴 10min 使其中的纤维素酶灭活,然后测量酶解液中的葡萄糖含量。1.4添加剂添加试验根据我们前期实验结果,选取吐温 80、茶皂素、BSA 和木聚糖酶等 4 种添加剂分别按照 30、40、40、0.8mg/g 底物进行添加,探究不同种类添加剂对酶解效率的影响10。1.5分析方法1.5.1组分分析预处理液及酶解液中的葡萄糖、木糖含量通过高效液相色谱仪 HPLC(UV-2600,岛津(香港)有限公司
14、)测定,所用色谱柱为 KS801 柱,配有示差折光检测器。检测条件为:流动相为经过脱气处理的去离子水,流速为0.4mL/min,柱温为 60;进样量为 10L,检测运行时间为 30min10。预处理液及酶解液中的葡聚糖、木聚糖含量的测定,需要先将低聚糖降解为单糖,再通过单糖的增加量计算。具体操作步骤为:取 2mL 预处理液于玻璃耐压瓶中,加入 10mL4%的稀硫酸,摇匀后置于高压灭菌锅中,在 121 下反应 1h,反应完成后,待高压灭菌锅内温度降至室温,将中和后液体通过 HPLC 测量其中的总葡萄糖和总木糖含量。1.5.2扫描电镜(SEM)分析采用 EVO18 扫描电镜(CarlZeissAG
15、,Germany)对杨木原料以及预处理样品的微观物理形态变化进行分析。取少量杨木原料以及预处理后的样品,充分烘干后研磨粉碎,均匀地洒落在贴有导电双面胶的样品台上,用吸耳球吹去未被粘牢的样品颗粒,在真空环境下进行镀金处理,在物料表面蒸镀一层导电层后,进行扫描电镜分析,摄像记录,加速电压为 10kV。1.5.3X-射线衍射(XRD)分析杨木原料和预处理样品的结晶度指数(XCrI)是用BrukerD8AdvanceX 射线衍射仪(BrukerCorporation,Germany)测定的。采用Al 靶产生的X 射线(Ka=0.154nm),用 Ni 滤波片滤掉特定波长的光。衍射角(2)的扫描范围为
16、580,扫描速度为 2/min,扫描电压 30kV,扫描电流 30mA。结晶度指数(XCrI)由衍射图谱上结晶峰的强度与总强度(I002)的高度比确定13,如式(1):XCrI=I002IamIam100(1)式中 I002是 22.5左右的主峰的衍射强度,Iam是 18左右的无定形区域的衍射强度。1.5.4数据处理方法酶解过程中葡萄糖得率及葡萄糖增长率的计算方式分别如式(2)和式(3)所示。葡萄糖得率=酶解液中的糖含量原料中的糖含量1.1100(2)葡萄糖增长率=添加添加剂的糖得率未添加添加剂的糖得率未添加添加剂的糖得率100(3)2结果与分析2.1不同金属盐强化的乙醇预处理对杨木的影响本研
17、究探讨了不同金属盐强化的乙醇预处理对杨木原料的影响,预处理后的固体回收率和化学组成分析如198农业工程学报(http:/www.tcsae.org)2023年表 1 所示。由表可知,杨木原料中葡聚糖、木聚糖、酸不溶性木质素(acidinsolublelignin,AIL)和酸溶性木质素(acidsolublelignin,ASL)的含量分别为 45.56%、14.98%、22.86%和 3.31%。经预处理后,样品中半纤维素和木素的质量分数显著降低,这是因为金属盐强化乙醇破坏木素和半纤维素中的酯键、醚健以及糖苷键所致14;由于木素和半纤维素的去除,使得预处理后杨木中纤维素含量迅速增加。对于 F
18、eCl3、CrCl3、CuCl2、FeCl2、ZnCl2和 MnCl2等过渡金属盐强化的乙醇预处理样品来说,半纤维素和木素的质量分数仅为 2.27%9.18%和 5.49%11.06%,而纤维素的质量分数增至70%左右,这说明半纤维素和木素的去除不仅能够打破由纤维素、半纤维素和木素所形成的致密结构,而且纤维素含量的增加为后续纤维素酶的酶解提供更多地可接触位点。对于碱土金属盐(MgCl2和 CaCl2)和碱金属盐(NaCl 和 LiCl)强化乙醇预处理样品来说,半纤维素和木素的降解有限,从而得到较高的固体回收率,且纤维素的含量仅有些许升高。表1不同金属盐强化乙醇预处理对固体回收率及杨木组分的影响
19、Table1Effectofmetal-saltscatalyzedethanolpretreatmentonsolidrecoveryandchemicalcompositionsofpoplar%不同预处理Pretreatment固体回收率Solidsrecovery葡聚糖Cellulosecontent木聚糖Xylancontent酸不溶木素Acid-insolublelignincontent酸溶木素Acid-insolublelignincontentRaw45.5614.9822.863.31FeCl353.4178.535.965.832.45CrCl351.9678.882.2
20、73.472.51CuCl253.6878.065.863.172.32FeCl253.2678.482.694.602.50ZnCl261.1069.279.188.202.86MnCl261.8667.449.017.272.98MgCl259.3368.058.529.032.99CaCl266.9253.108.4712.733.58NaCl73.9356.6212.8615.374.04LiCl72.7154.8611.6415.934.19由表 1 可知,在金属盐强化的乙醇预处理过程中会发生半纤维素和木素的去除以及部分纤维素的降解,因此我们对预处理液中单糖和聚糖含量进行测定,结果如
21、表 2 所示。由表可知,预处理液中的总葡萄糖质量分数非常少(1.08g/100g 原料),且大部分是以低聚葡萄糖的形式存在,这说明金属盐强化的乙醇预处理可以保留杨木中大部分纤维素。对于金属盐强化的乙醇预处理来说,半纤维素降解产物总木糖的质量分数在 2.20g/100g原料以上,最高可达 4.83g/100g 原料,且大部分以低聚木糖的形式存在。由此可见,金属盐强化的乙醇预处理液中释放的木糖比葡萄糖多,这是因为相对于结晶态纤维素来说,无定形态的半纤维素更容易降解15-16,且金属盐强化的乙醇预处理更有利于低聚木糖的回收,从而提升其利用价值。表2不同金属盐强化乙醇预处理液中糖的含量Table2Su
22、garcontentinmetal-saltscatalyzedethanolpretreatmentliquorg(100g)1预处理条件Pretreatmentconditions葡萄糖单糖Glucosemonomer葡萄糖聚糖Glucoseoligomer总葡萄糖Totalglucose木糖单糖Xylosemonomer木糖聚糖Xyloseoligomer总木糖TotalxyloseFeCl30.110.440.540.392.142.53CrCl30.850.241.080.283.323.60CuCl20.280.460.740.394.454.83FeCl20.300.160.46
23、3.091.634.72ZnCl20.190.560.750.133.013.14MnCl20.190.190.380.612.393.00MgCl20.150.360.500.002.202.20CaCl20.100.370.470.002.312.31NaCl0.150.150.412.352.76LiCl0.210.211.141.072.212.2预处理后样品表征为对比不同价态金属盐强化乙醇预处理杨木表面形貌和结晶度的影响,分别对三价态金属盐(FeCl3和CrCl3)、二价态过渡金属代表(FeCl2)和碱土金属代表(MgCl2)以及一价态金属盐(NaCl 和LiCl)进行表征分析。2.
24、2.1扫描电镜分析对预处理前后杨木表面形貌放大 2000 倍后进行扫描电镜分析,结果如图 1 所示。与预处理后样品相比,未经处理的杨木表面完整光滑,纤维束排列整齐,这样致密结构阻碍了纤维素酶对纤维素的进攻,不利于后续的酶水解。按照金属盐价态进行对比,可以发现一价态金属盐如 NaCl 和 LiCl 处理后的杨木表面仍然保持较为光滑的表面,出现少许裂纹。二价态金属盐如 FeCl2和MgCl2处理后的杨木表面裂纹明显增多并出现少量孔洞。而三价态金属盐如 FeCl3和 CrCl3处理后的杨木表面裂纹多,有较多的孔洞,表面粗糙。因此,可以得出不同金属盐强化的乙醇预处理后,杨木基质表面出现了裂纹和孔洞,变
25、得松散、无序,使纤维暴露程度增大,结合表 1 中不同预处理后杨木组分剩余的木质素和半纤维素,可以得出这是由于金属盐强第12期朱光辉等:金属盐强化乙醇预处理和添加剂联合对杨木酶解的影响199化乙醇预处理过程中半纤维素和木素的去除,使原本的致密结构遭到破坏,为纤维素酶提供更多的活性位点,提高酶对纤维素的可及性,从而提高其酶解效率17-18。a.原料a.Rawb.c.b.FeCl3 c.CrCl3 d.FeCl2e.MgCl2f.NaClg.LiClf.NaClg.LiCl图 1杨木原料和不同金属盐强化乙醇预处理后样品的SEM 图像Fig.1SEMimagesofrawandmetal-saltsc
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