枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对赭曲霉的抑制作用.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 125枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对 赭曲霉的抑制作用余 璐,魏 琛,张凯歌,林亲录,王青云*(中南林业科技大学食品科学与工程学院,湖南 长沙 410004)摘 要:采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PW2菌株所产抗霉活性挥发性物质(volatilecompound,VC)进行成分鉴定,选取所鉴定出的单个成分采用平板对扣法测定其对赭曲霉(Aspergillus ochraceus)的抑制率,以活性最强的VC作为关键抗霉挥发性物质(keyantifungalvolatilecompo
2、und,KAVC),进一步研究KAVC对赭曲霉生长和产毒的作用效果及机理。结果表明:PW2菌株所产VC中鉴定出酯、醛、烷烃、醇、酮、酸、烯烃等41 种成分,单个成分抗霉实验发现异辛醇对赭曲霉的抑制活性最强。在接触条件下异辛醇剂量为1 562.5 L/L时可以完全抑制赭曲霉生长,且使赭曲霉毒素A含量降低23.67%。在挥发条件下异辛醇剂量为112 L/L时可以完全抑制赭曲霉生长,281 L/L时可以完全杀死赭曲霉。经异辛醇处理后的赭曲霉孢子外观褶皱、凹陷和干瘪,且细胞膜完整性被破坏,菌丝麦角甾醇含量降低了42.68%65.40%,胞内核酸和蛋白泄漏。说明异辛醇能够通过破坏赭曲霉细胞膜抑杀赭曲霉,
3、可为其在食品防霉中的应用提供理论依据。关键词:枯草芽孢杆菌;挥发性物质;异辛醇;赭曲霉;赭曲霉毒素A;抑制作用Effect of Volatile Compounds from Bacillus subtilis PW2 against Aspergillus ochraceusYU Lu,WEI Chen,ZHANG Kaige,LIN Qinlu,WANG Qingyun*(College of Food Science and Engineering,Central South University of Forestry Science and Technology,Changsha
4、410004,China)Abstract:The composition of antifungal volatile compounds(VC)produced by Bacillus subtilis PW2 was identified by solid phase microextraction(SPME)coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Then,the identified single components were selected to determine their inhibitory ef
5、fect against Aspergillus ochraceus by plate buckling method,and the effect and mechanism of the most active VC on the growth and toxicity of A.ochraceu.The results showed that 41 components including esters,aldehydes,alkanes,alcohols,ketones,acids and olefins were identified in the VC produced by PW
6、2.Among these compounds,2-ethyl hexanol(2-EH)had the strongest inhibitory activity against A.ochraceus.Direct contact with 2-EH at a dose of 1 562.5 L/L completely inhibited the growth of A.ochraceus and reduced the content of ochratoxin A(OTA)by 23.67%.2-EH vapor at doses of 112 and 281 L/L complet
7、ely inhibited and killed A.ochraceus,respectively.The spores of A.ochraceus treated with 2-EH appeared wrinkled,sunken and shriveled,and the integrity of the cell membrane was destroyed.Furthermore,the mycelial ergosterol content decreased by 42.68%65.40%,and nucleic acid and protein leaked out of t
8、he cells after this treatment.This study shows that 2-EH can inhibit and kill A.ochraceus by destroying its cell membrane,which provides a theoretical basis for the application of 2-EH in the prevention of food mildew.Keywords:Bacillus subtilis;volatile compounds;2-ethyl hexanol;Aspergillus ochraceu
9、s;ochratoxin A;inhibitionDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220802-023中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)14-0125-09引文格式:余璐,魏琛,张凯歌,等.枯草芽孢杆菌PW2产挥发性物质对赭曲霉的抑制作用J.食品科学,2023,44(14):125-133.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220802-023.http:/收稿日期:2022-08-02基金项目:湖南省自然科学基金项目(2019JJ40541);湖南省教育厅重点项目(20A513);中南林业科技大学
10、博士科研启动基金项目(2018YJD38)第一作者简介:余璐(1997)(ORCID:0000-0003-1276-2160),女,硕士研究生,研究方向为食品安全检测与控制技术。E-mail:*通信作者简介:王青云(1975)(ORCID:0000-0002-6144-1657),女,副教授,博士,研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail:T126 2023,Vol.44,No.14 食品科学 生物工程YU Lu,WEI Chen,ZHANG Kaige,et al.Effect of volatile compounds from Bacillus subtilis PW2 agains
11、t Aspergillus ochraceusJ.Food Science,2023,44(14):125-133.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220802-023.http:/赭曲霉(Aspergillus ochraceus)广泛生长在粮食、水果、咖啡、油料、茶叶等1食品原料及其加工产品。赭曲霉产孢能力很强,其孢子散落在空气中能够诱导儿童哮喘2和人类肺病3。其产生的次级代谢产物赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一种肾毒性真菌毒素,具有致癌、致畸、遗传毒性和免疫抑制作用4。OTA经
12、由胃肠道吸收后,经血液流到肾脏,且在人或动物体内不易代谢消除,易在血液及消化组织器官中累积,可引发亚急性或慢性中毒5。OTA在1993年被国际癌症研究会定为2B组致癌物质6。目前,物理防霉方法常用气调控制和低温控制,但能耗费用高,辅助设施不成熟7;传统的化学熏蒸法中常使用磷化铝、氯化苦、环氧乙烷等,其对环境造成的负面影响和对人类健康的威胁问题日益突出8。因此,探寻低毒高效的绿色防霉剂已成为当今食品防霉的必然需求。芽孢杆菌(Bacillus)对真菌的抑制作用多是源于其产生的抗菌蛋白9、脂肽类10及挥发性物质(volatile compounds,VC)11-12,其中抗菌蛋白和脂肽类的研究已比较
13、成熟,而具有抗霉活性的VC开始成为近年来研究的热点。研究表明,芽孢杆菌所产具有抗霉活性的挥发性复合物的主要成分有醇、醛、酮、酸、酚类化合物及硫化物等13-14;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)KA9产生的挥发性复合物不仅对辣椒植物生长有促进作用,还对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)有生防效果15;贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)所产挥发性复合物能够抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)等病原真菌的菌丝生长16;解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)T-5产生的挥发性复合物能显著抑制引起番茄青枯病的青枯雷尔氏菌的生长17。
14、芽孢杆菌所产挥发性复合物不仅可抑制上述田间型植物病原真菌,还可用于采后储藏期间的生物防治。甲基营养芽孢杆菌(B.methylotrophicus)BCN2和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)BCN10产生的挥发性复合物可以抑制从枇杷果实中分离的5 种采后病原菌生长18;巨大芽孢杆菌(B.megaterium)产生的挥发性复合物明显抑制了稻谷中霉菌总数的增加,显著降低了稻谷中黄曲霉毒素的含量19。然而,关于芽孢杆菌所产VC对赭曲霉的抑制作用迄今鲜见研究报道。实验室在前期研究中从稻谷中分离出1 株产抗霉VC的枯草芽孢杆菌PW220,本实验以其所产VC为研究对象,鉴定其组分,测定所鉴定
15、出单个化合物标准品对赭曲霉生长的抑制效果,从中筛选出关键抗霉挥发性物质(key antifungal volatile compound,KAVC),研究KAVC对赭曲霉生长及产毒的抑制效果,并探讨其抗霉作用机理,旨在为探寻新型的食品用防霉熏蒸剂提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂枯草芽孢杆菌PW2菌株由本实验室在前期研究中从市售籼稻中分离、鉴定并保存;赭曲霉 中国农业微生物菌种保藏管理中心。异辛醇(纯度99.5%)、2-壬酮(纯度99%)、异丁酸(纯度99%)、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯(纯度98.5%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;十二醇(纯度98%)Sigm
16、a Aldrich(上海)贸易有限公司;赭曲霉毒素酶联免疫定量检测试剂盒 上海恒远生物科技有限公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI)、琼脂(生物试剂)北京索莱宝科技有限公司;牛肉膏、蛋白胨(均为生物试剂)北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠、葡萄糖(均为分析纯)国药集团化学试剂有限公司;氯霉素(纯度98%)上海麦克林生化科技股份有限公司。营养琼脂(nutrient agar,NA)培养基:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,琼脂1520 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.47.6;营养肉汤(nutrient broth,NB)培养基:NA配方中不加琼脂;马铃
17、薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基:去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂1520 g,氯霉素0.3 g,蒸馏水1 000 mL,自然pH值;马铃薯葡萄糖液体(potato dextrose broth,PDB)培养基:PDA配方中不加琼脂;沙氏葡萄糖肉汤(sabouraud dextrose broth,SDB)培养基:蛋白胨10 g,葡萄糖40 g,蒸馏水1 000 mL。以上培养基均在121 灭菌20 min后备用。1.2 仪器与设备MJ-54A型灭菌锅 施都凯仪器设备(上海)有限公司;Airtech SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州安泰空气技
18、术有限公司;DVB/CAR/PDMS(50/30 m)型萃取头 美国Supelco公司;7890B-5977B型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;MJX-250B型霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司;SpectraMax i3x型多功能酶标仪 美国Moleculer Devices公司;Quanta FEG250型扫描电子显微镜 美国FEI公司;Ni-U型正置荧光微分干涉显微镜 尼康仪器(上海)有限公司。生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.14 1271.3 方法1.3.1 赭曲霉孢子菌悬液制备用含0.05%(V/V)吐温80的无菌水冲洗PDA斜面上的赭曲霉孢子,4 层
19、无菌擦镜纸过滤,调节孢子悬液浓度至1106 个/mL,于4 冰箱保存备用。之后提到的赭曲霉孢子悬液,如无特殊说明,均为按此方法制备的孢子悬液。1.3.2 PW2所产VC成分鉴定取1 环PW2斜面菌种接到装有10 mL NB培养基的顶空瓶中,以相同条件下不接菌的培养基为对照,30、150 r/min培养3 d。采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术21对PW2菌株所产VC进行成分鉴定。采用峰面积归一法计算各成分的相对含量。1.3.3 VC中抑制赭曲霉生长的KAVC筛选根据VC成分鉴定结果,选取鉴定出的单个成分并购买标准品,采用平板对扣法22测定各标准品对赭曲霉生长的抑制作用。平板对扣法的操作为:
20、取5 L赭曲霉孢子悬浮液接种于PDA平板中央,另一平板中放入含20 L单个待测化合物的滤纸片,立即用保鲜膜绕皿口3 圈进行密封。以相同条件下不加化合物的处理作为对照。30 恒温培养箱内培养7 d,对照组的菌落生长完全,便停止培养。观察记录平板中赭曲霉的生长情况,测量菌落直径(cm),按下式计算各标准品对赭曲霉菌落生长的抑制率。对比分析抑制率的高低,找出抑制赭曲霉生长的KAVC。?/%?100(1)1.3.4 倍半稀释法测定KAVC在接触条件下对赭曲霉的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)取1 mL赭曲霉孢子悬液加到含有9 mL PDB培养基的
21、锥形瓶中并摇匀,取190 L加入96 孔板的第1列孔中,第29列孔中均加入100 L,然后在第1列孔中加入KAVC 10 L,采用倍半稀释法23进行连续稀释。在第10列孔中加入不含孢子的PDB培养基100 L,第11列孔中加入含孢子的PDB培养基100 L,盖上盖子用保鲜膜缠绕3 圈封口,置于30,培养5 d后对照组菌丝正常生长并产孢。在每孔加入1 mg/mL刃天青溶液10 L,混匀,30 孵育12 h,霉菌生长较多的孔中刃天青蓝色褪去,转变为粉红色甚至无色。通过目视观察,将刃天青颜色无明显变化的孔对应的KAVC的最低浓度定义为MIC值。在后续机理研究的实验中异辛醇的剂量均基于此实验结果。1.
22、3.5 平板对扣法测定KAVC在挥发条件下对赭曲霉的MIC和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)平板对扣法操作如1.3.3节所述,滤纸片上KAVC添加量设置为0、10、20、30、40、50、60 L,对应的顶空含量分别为0、56、112、169、225、281 L/L和337 L/L(皿内径为9 cm,高2.8 cm,容积为0.178 L)。30 培养7 d后以肉眼观察PDA平板上赭曲霉无生长,转接至新鲜PDA平板上,30 培养5 d后可以恢复生长处理对应的最低浓度为MIC,不能恢复生长处理对应的最低浓度为MBC。1.3.6 KAVC对
23、赭曲霉产毒的影响在10 mL PDB培养基中接入100 L赭曲霉孢子悬液,30、150 r/min培养48 h后,在无菌条件下加入KAVC,使之剂量分别为0、1/4 MIC、1/2 MIC和MIC,相同条件下继续培养5 d。培养结束后用Whatman No.1滤纸过滤,采用酶联免疫吸附法24-25测定滤液中OTA的含量。1.3.7 KAVC抑制赭曲霉生长作用机理分析1.3.7.1 扫描电镜观察用SDB培养基替代1.3.1节无菌水制备含1107 个/mL赭曲霉孢子的SDB培养基,取3 mL加入EP管中,再加入KAVC使之剂量分别为0、1/2 MIC、MIC、2 MIC,于30、150 r/min
24、培养10 h,将孢子培养物5 000g离心5 min,弃去上清液,收集赭曲霉孢子,通过扫描电镜26观察KAVC对赭曲霉孢子形态的影响。1.3.7.2 KAVC对细胞膜完整性的影响赭曲霉孢子培养方法、KAVC剂量分别为0、MIC、2 MIC、4 MIC,培养时间为12 h。将孢子培养物5 000g离心5 min,弃去上清液,用磷酸盐缓冲液洗涤2 次,用5 g/mL PI对孢子样品染色,37、150 r/min孵育30 min,再用磷酸盐缓冲液洗涤3 次,除去未进入细胞内的PI后,吸取20 L在干净的载玻片上,盖上盖玻片,用正置荧光微分干涉显微镜27拍照观察。1.3.7.3 麦角甾醇含量的测定取1
25、5 mL赭曲霉孢子悬液加入135 mL PDB培养基中,30、150 r/min培养3 d,收集菌丝,称取1 g菌丝球分别放入异辛醇剂量为0、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC的无菌水中,于30、150 r/min培养12 h,过滤,将菌丝球放入试管中,加入5 mL 25 g/100 mL KOH-乙醇溶液,混合3 min,在85 水浴中孵育4 h,冷却,加入5 mL正庚烷和2 mL无菌水,然后强力旋流搅拌3 min,静置1 h,取上层正庚烷用扫描分光光度计在230300 nm范围内扫描,计算菌丝球中麦角甾醇含量23。?/%?A282 nm/290?24?28?DHE%(2)A230 nm
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