巨噬细胞在脓毒症小鼠急性肾损伤发生中的可能作用机制.pdf
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1、临床和实验医学杂志2 0 2 3年8 月第2 2 卷第15期D0I:10.3969/j.issn.1671-4695.2023.15.001文章编号:16 7 1-46 9 5(2 0 2 3)15-156 9-0 5巨噬细胞在脓毒症小鼠急性肾损伤发生中的可能作用机制1569论著王海曼张萌段美丽”(首都医科大学附属北京友谊医院重症医学科北京10 0 0 50)【摘要】目的探讨小鼠肾脏组织巨噬细胞的生理构成及其在脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)时的变化及可能作用机制。方法将54只小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、假手术组、CLP组,每组各18 只小鼠。正常对照组为正常小鼠,假手术组小鼠只打
2、开腹腔不建模,CLP组小鼠采用盲肠结扎穿刺法(CLP)制作SA一AKI模型。观察时间点为术后第0.5天、第1天、第2 天和第2 1天。采用酶联免疫吸附试验测定外周血肌酐水平、苏木精和伊红染色评估肾脏组织病理。采用流氏细胞分析法测定小鼠巨噬细胞的构成及功能指标。应用单细胞测序技术测定SA一AKI急性期巨噬细胞差异性表达的基因,再用KEGG数据库富集得到相关信号通路,以推测巨噬细胞在AKI过程中所发挥的可能作用机制。结果生理状态下,小鼠肾脏组织的固有巨噬细胞分为两群:MC1和MC2二者在数量上差异无统计学意义(P0.05);M C 1表达iNOS的量高于MC2,差异有统计学意义(P0.05)。A
3、K I 时肾脏巨噬细胞显著增多、以MC1为主。术后第0.5天、第1天和第2 天,CLP组MC2细胞表达iNOS表达量均显著高于假手术组,差异均有统计学意义(P 0.0 5)。单细胞测序技术将小鼠肾脏组织的巨噬细胞注释出5群:Cluster0至Cluster4,应用KECG富集差异基因,其中四群巨噬细胞均富集至氧化磷酸化和活性氧通路。结论生理状态下的小鼠肾脏组织内,固有巨噬细胞分两群,共同维持肾脏组织的稳态。巨噬细胞可能通过改变其氧化磷酸化过程来达成代谢重编程,促进炎症反应的发生或增强,最终导致AKI的发生。【关键词】小鼠脓毒症急性肾损伤巨噬细胞代谢重编程发生机制Possible role of
4、 macrophages in the occurrence of acute kidney injury in sepsis mice.WANG Hai-man,ZHANG Meng,DUAN Mei-li.De-partment of Critical Care Medicine,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China.Abstract Objective To explore the physiological composition of macrophages in kid
5、ney,as well as the possible role of macrophages insepsis associated acute kidney injury(SA-AKI).Methods Fifty four mice were divided into normal control group,Sham surgery group andCLP group according to the random number table,with 18 mice in each group.The normal control group was normal mice,the
6、Sham surgery groupmice only opened the abdominal cavity without modeling,and the CLP group mice made SA-AKI models by cecal ligation and puncture(CLP).The level of creatinine in peripheral blood was measured by enzyme-linked immunosorbent assay,and renal histopathology was evaluated by Hae-matoxylin
7、 and eosin staining.The composition and functional indicators of mouse macrophages were measured using flow cytometry.The differenti-ally expressed genes of SA-AKI macrophages in the acute phase were determined.Single-cell sequencing technology was used,and KEGG data-base was used to enrich the rele
8、vant signal pathways to speculate the possible mechanism of macrophages in the AKI process.Results Underphysiological conditions,the resident macrophages were divided into two groups by flow cytometry:MCI and MC2,both of which had no statisticdifference in the number.The expression of iNOS of MC1 wa
9、s significantly higher than that of MC2,the dfference was statistically significant(P0.05).During AKI,there was a significant increase in renal macrophages,mainly MC1.The expression of iNOS in MC2 cells of CLP groupwas significantly higher than those of the Sham surgery group on the O.5 day,the firs
10、t day and the second day after operation,the dfferences werestatistically significant(P 0.05).Single-cell sequencing technology annotated five groups of macrophages in mouse kidney tissue:Cluster 0 toCluster 4,and their differentially expressed genes were enriched by KEGG.The differentially expresse
11、d genes of the four groups of macrophageswere allenriched to oxidative phosphorylation and reactive oxygen pathway.ConclusionUnder physiological conditions,renal macrophages aredivided into two groups:MCl and MC2,which may be derived from different sources,but jointly maintain the homeostasis of ren
12、al tissue.Macro-phages may achieve metabolic reprogramming by altering the process of oxidative phosphorylation,which in turn leads to the occurrence or enhance-ment of inflammatory responses,ultimately leading to acute kidney injury.Key words Mice;Sepsis;Acute kidney injury;Macrophages;Metabolic re
13、programming;Pathogenesis脓毒症是一种危及生命的临床综合征,其主要特征是宿主对感染的反应失调并因此导致器官功能障碍,其中肾脏是最早被累及的器官之一,急性肾损伤(acutekidney injury,A K I)是脓毒症最主要和最严重的并发症之一2 。肾脏疾病约57.3%的危重症患者会合并 AKI,基金项目:首都临床特色应用研究与成果推广项目(编号:7171100001017064)*通讯作者:段美丽,E-mail:病死率高达50%3。合并 AKI 的脓毒症患者的住院时间和住院费用均会增加,与不良预后相关;且半数幸存者会遭受永久性肾脏损伤或进展为慢性肾脏疾病,增加患者经济负
14、担的同时也严重降低了患者的生活质量。脓毒症导致脏器损伤主要通过3种病理生理机制来完成:炎症反应、微循环功能障碍和代谢重编程5,这3种情况都离不开机体免疫反应。研究表明,由免疫介导的炎症反应在肾损伤发生中至关重要6 。作为既是效应细胞又是抗原提呈细胞的巨噬细胞,在介导免疫性:1570:肾损伤中起到重要作用。在肾脏绝对或者相对缺血时,肾脏微循环的内皮细胞及血管基底膜的改变会导致更多的巨噬细胞和单核细胞进入肾脏。活化的巨噬细胞不仅具有强大的吞噬活性,还能释放出多种炎症因子,如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子等,继而导致肾损伤的进一步发展。目前巨噬细胞在肾功能损伤及修复中的研究模型多为缺血再灌注和药物性肾
15、损伤模型,脓毒症导致AKI的研究较少。本研究拟通过盲肠结扎穿刺法(cecum ligation and puncture,CLP)制作脓毒症相关急性肾损伤(sepsis associated acute kidney injury,SA -AKI)小鼠模型,探索肾脏巨噬细胞在急性肾损伤发生中所起到的可能作用。现报道如下。1材料与方法1.1实验动物及分组清洁级雄性C57BL/6小鼠共54只,8 10 周龄,体重2 0 2 7 g。购自中国北京华阜康生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2 0 19 0008。所有小鼠均在同一实验室按照清洁级要求适应性饲养1周,室温(2 0 1),湿度(6
16、 0 10)%,每日光照12 h。所有小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、假手术组、CLP组,每组各18 只小鼠。正常对照组为正常小鼠,假手术组小鼠只打开腹腔不建模,CLP组小鼠用CLP制作SA-AKI模型。本研究获得首都医科大学附属北京友谊医院动物使用伦理委员会的批准(批号:21-2046)。1.2主要试剂及设备MULTISKANMK3全自动多功能酶标仪(美国Thermo公司);CytoFLEXS流式细胞仪(美国贝克曼公司);EPICSALTRA流式细胞分析分选系统(美国 Beckman Coulter 公司);S1000 Thermal Cycler(美国BioRad公司);Novaseq
17、6000 Sequencer(美国Ilu-mina公司)。小鼠肌酸酐酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司);苏木精和伊红染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司);抗小鼠CD45、Ly 6 G、F4/8 0、Ly-6C、CD 11b 抗体(美国Biolegend公司);抗小鼠iNOS、Arginase1抗体(美国eBioscience公司)。1.3脓毒症模型制作应用CLP法制作SA-AKI模型7 。本手术结扎50%7 0%的盲肠,制作成中度至重度脓毒症模型,以保证急性肾损伤的发生。中度至重度脓毒症小鼠在造模
18、后逐渐出现竖毛、腹泻或脓尿,饮水、进食及活动次数明显减少,且活动失去昼夜规律。1.4观察指标及方法1.4.1样本采集(1)血:将小鼠麻醉后处死,眼眶取血,静置后以30 0 0 r/min转速,离心半径10 cm,离心15min,收集上清液、标记并立即放人8 0 冰箱中冻存。(2)肾脏组织:各组小鼠到术后第0.5天、第1天和第2天后均予麻醉处死,分别将双肾取出、去除被膜,将左肾浸人4%多聚甲醛中固定、时间长于2 4h,用于包埋、切Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol.22,No.15Aug.2023片及苏木精和伊红染色。将右肾匀浆、消
19、化后进行流式检测。另外,取正常对照组、假手术组和 CLP组术后1 d的小鼠各3只,麻醉后处死,取双肾,将其剪碎、解离,制成单细胞悬液,用于单细胞测序。1.4.2外周血肌酐测定应用ELISA试剂盒测定小鼠血肌酐值。先按照次序加人标准品溶液于酶标板的空白微孔中,再于空白微孔中加人样品,在空白对照孔中加人磷酸盐缓冲液(pH7.07.2)。各孔中加入50 L的酶标记溶液(不含空白对照孔),搅拌均勾、充分混合后于37 孵育反应1h。清洗、拍干。各孔依次加人50LSubstrateA和50 LSubstrateB后于37 避光反应1015m in。后于各孔加终止液以终止反应。以空白孔调零,立即使用酶标仪依
20、序测量450 nm波长处各孔的吸光度。测定应在加终止液后15min以内进行,最后进行结果计算。1.4.3肾组织病理切片的制备及苏木精和伊红染色术后第0.5天、第1天和第2 天,将肾组织于4%多聚甲醛固定后,7 0%乙醇4冰箱保存。经脱水后进行常规石蜡包埋、切片,片厚4m,随后进行常规苏木精和伊红染色。根据Paller评分标准8 评估肾组织病理损伤程度。Paller评分包括以下4点:肾小管是否明显扩张、细胞扁平;刷状缘是否有损伤、脱落;是否有管型;肾小管管腔内是否有脱落、坏死的细胞。按照不同损伤程度进行评分。1.4.4流氏细胞分析法检测巨噬细胞等的数量及功能指标将肾脏组织匀浆、消化、制作细胞悬液
21、、过滤、重悬后再过滤。在血细胞计数仪上使用台盼蓝排除法计数细胞的数量,并将2 0 0 万个细胞加入到一个1.5mL的流式管中进行破膜后,加人抗体室温孵育30 min后以150 0 r/min速度,离心半径8 cm,离心5min,后重悬上机检测。1.4.5单细胞测序利用CellRanger对合格的单细胞下机数据进行原始数据处理。后进行细胞分群、差异性分析与富集分析。1.5统计学处理采用SPSS22.0统计分析软件对本研究数据进行处理,符合正态分布的计量资料以均数土标准差(xs)表示,两组间变量比较应用独立样本t检验,多组样本间比较采用单因素方差分析;不符合正态分布的计量资料采用非参数秩和检验(M
22、annW h it-neyU);应用GraphpadPrism9.0软件进行图形绘制;P 0.0 5)。见图1。MC1CD11hF4/80 1571 著高于MC2,差异有统计学意义(t=3.451,P 0.0 5)。见图4。MC1INOS6.65MC1MC2巨噬细胞MC2INOS1.00SSCSON!2-MCIiNOS巨噬细胞MC2图1生理状态小鼠肾脏组织MC1和MC2的数量100-Arginase:1注:ns:与MC2比较,P0.05Arginaset77-32.1.2生理状态下MC1高表达Ly-6C、M C2 低表达Ly-6C生理状态下,MC1和MC2表达Ly-6C的量分别为(48.2 5
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