几丁质降解菌Acinetobacter sp.WML1的生物安全性和发酵优化.pdf
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1、DOI:10.16605/ki.1007-7847.2022.09.0202几丁质降解菌 Acinetobacter sp.WML1 的生物安全性和发酵优化唐白露1,刘木兰1,旷琦颖1,何雪婷1,刘佳1,唐映红1,何海伦2*(1.湖南文理学院 生命与环境科学学院 常德市农业生物大分子研究中心 环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室,中国湖南 常德 415000;2.中南大学 生命科学学院,中国湖南 长沙 410013)摘要:Acinetobacter sp.WML1 分离自淡水湖渔场沉积物,能降解几丁质,具有一定的应用价值。为了评价菌株 WML1 的生物安全性,为菌株的安全使用提供参考和保
2、障,采用常规纸片扩散法检测耐药性,用血琼脂平板划线法检测溶血性,用溴甲酚紫显色法检测氨基酸脱羧酶活性,用试剂盒测定硝酸还原酶活性。在菌株生物安全性分析的基础上,通过单因素试验法和正交试验法进行菌株 WML1 产几丁质酶发酵条件的优化。结果表明,菌株 WML1 对多种抗生素敏感,无溶血性,无硝酸还原酶活性,有精氨酸脱羧酶活性及微弱的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶活性;其最优产酶条件为 0.4%黄豆粉、0.20%半乳糖、0.03%KH2PO4、0.07%K2HPO4、0.002%FeSO4、0.05%MgSO4 7H2O、0.001%ZnSO4、0.60%胶体几丁质、pH 9.5、5.0%的接种量、25 m
3、L 的装液量(对应 250 mL容量瓶)、37的培养温度,优化后的几丁质酶活为(2.72依0.09)U/mL。综上所述,不动杆菌 WML1 在使用安全性上危害较小,可防可控,经发酵条件优化后其所产几丁质酶的活性提高了约 4.61 倍,为产几丁质酶菌株的工业化应用提供了理论基础。关键词:几丁质降解菌;几丁质酶;不动杆菌 WML1;生物安全性;发酵优化中图分类号:Q939.9文献标志码:A文章编号:1007-7847(2023)04-0361-10Biosafety and Fermentation Optimization of Acinetobacter sp.WML1 for Chitina
4、se ProductionTANG Bailu1,LIU Mulan1,KUANG Qiying1,HE Xueting1,LIU Jia1,TANG Yinghong1,HE Hailun2*(1.Hunan Provincial Key Laboratory for Health Aquaculture and Product Processing in Dongting Lake Area,Changde ResearchCenter for Agricultural Biomacromolecule,College of Life and Environmental Sciences,
5、Hunan University of Arts and Science,Changde 415000,Hunan,China;2.School of Life Sciences,Central South University,Changsha 410013,Hunan,China)Abstract:Acinetobacter sp.WML1 was isolated from the fishery sediments of freshwater lakes and provedto have application value due to its ability to degrade
6、chitin.Herein,the biosafety of the chitinase-producingstrain WML1 was first evaluated for application.The drug resistance of the strain was detected with the diskdiffusion method,haemolytic activity was analyzed by streaking the blood agar plate,amino acid decarboxy-lase and nitrate reductase activi
7、ties were measured by the chromogenic assay with bromocresol purple andnitrate reductase activity assay kit,respectively.On the basis of biosafety analysis,the fermentation condi-tions of the strain were then optimized by single-factor and orthogonal tests for chitinase production.The re-sults showe
8、d that the strain WML1 was sensitive to most antibiotics,and had no haemolytic activity or ni-trate reductase activity,had arginine decarboxylase activity and weak lysine and ornithine decarboxylase ac-收稿日期:2022-09-14;修回日期:2022-12-23;网络首发日期:2023-03-15基金项目:湖南省自然科学基金青年基金项目(2021JJ40377);湖南省自然科学基金面上项目(2
9、021JJ30029);湖南省教育厅科学研究一般项目(20C1270);常德市农业生物大分子研究中心开放课题(2020AB07);湖南省科技创新计划资助项目(2021RC1013)作者简介:唐白露(1991),女,湖南永州人,博士,讲师,主要从事环境功能微生物及功能产物的研究,E-mail:;*通信作者:何海伦(1976),女,湖南长沙人,博士,教授,博士研究生导师,主要从事微生物酶结构和功能及生物资源酶解利用的相关研究,Tel:0731-82650230,E-mail:。第 27 卷 第 4 期生命科学研究灾燥造援27 晕燥援4圆园23 年 8 月蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 砸藻泽藻葬则糟澡A
10、ug.圆园23窑 技术与应用 窑生命科学研究圆园23 年几丁质是自然界中含量仅次于纤维素的可再生资源,中国是几丁质的产量大国,其相关产业正成长为一个重要的高分子产业。利用几丁质的一种方法是将其降解成低相对分子质量的产物。几丁质酶酶解法是一种最理想的降解几丁质的方法,具有很多优点,如生产工艺简单、反应条件温和、降解产物容易控制、产物活性高、无污染等1。此外,几丁质酶在生物农药、食品及保健品、医药制品、环境废弃物管理等生物技术领域也具有广泛的应用2-4。细菌是自然界中几丁质的主要降解者,也是几丁质酶研究最多的来源之一。微生物胞外酶具有来源广、可分泌到胞外、生产周期短、易发酵、易提取、操作性强、经济
11、效益好等优点,在医学、食品、化工和饲料等领域具有广阔的应用前景和现实意义5-6。目前,已经发现的产几丁质酶的细菌种类很多,其中比较常见的有气单胞菌属、沙雷氏菌属、弧菌属和芽孢杆菌属7-8。有研究表明,在将废弃的粗制蟹壳转化为 N-乙酰葡糖胺时,来自枯草芽孢杆菌的几丁质酶优于作为商业化产品的灰色链霉菌的几丁质酶,转化率可达60%9。此外,有研究者通过优化菌株发酵生产几丁质酶的工艺来制备几丁寡糖或几丁单糖10-11。然而,绝大部分细菌产几丁质酶的能力不够理想,这使得产业化的几丁质酶价格昂贵,难以实现商业应用。因此,对不同环境来源的产几丁质酶菌株的研究,可为产几丁质酶微生物资源的开发和应用提供基础。
12、不动杆菌属(Acinetobacter)菌株较为常见,目前已有关于该属菌株产几丁质水解酶的报道。例如:顾张慧等12从海泥中筛选得到了产几丁质脱乙酰酶细菌 MCDA01,经单因素和正交试验优化其发酵条件后,所产几丁质脱乙酰酶的活性提高了 4.14 倍,具有工业应用潜力;Kim 等13从犊牛粪便中分离的新型产几丁质酶不动杆菌 HANDI 309可以在短时间内不经过任何预处理而实现几丁质酶的工业化生产,在食品和制药行业具有潜在的应用价值。但到目前为止,分离自淡水湖渔场沉积物的产几丁质酶的不动杆菌尚未见报道。此外,需要注意的是,细菌在应用过程中可能会存在一定的安全风险,如某饲料添加剂中的蜡状芽孢杆菌因
13、携带含四环素耐药基因(tetracyclin resistancegene B,tetB)的质粒,存在潜在的安全风险,从而被停用14。由此可见,为更好地实现产酶菌株的大规模生产和商业应用,在通过发酵优化提高产酶量之前,有必要对产酶菌株进行生物安全性分析。本研究首先对分离自津市西湖渔场沉积物中的产几丁质酶菌株 Acinetobacter sp.WML1(16SrRNA 基因序列号为 OM959512,与其系统发育关系最密切的有效命名的典型菌株 A.tandoii DSM14970T的 16S rRNA 基因序列的相似性为98.81%)的耐药性、溶血性、氨基酸脱羧酶活性和硝酸还原酶活性进行测定,从
14、耐药性和有害代谢产物两方面来评估菌株 WML1 的生物安全性,为菌株的安全使用提供参考和保障,随后采用单因素和正交试验法对菌株 WML1 产酶的发酵条件进行优化,为产几丁质酶菌株的工业化应用提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1样品来源菌株 WML1 分离自淡水湖渔场津市西湖渔场沉积物,由湖南文理学院生命与环境科学学院环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室分离并保存。1.1.2主要试剂和仪器实验使用的试剂主要有:几丁质、N-乙酰葡tivities.The optimal enzyme production conditions of strain WML1 were as follow
15、s:25 mL medium containing0.4%soybean powder,0.20%galactose,0.03%KH2PO4,0.07%K2HPO4,0.002%FeSO4,0.05%MgSO4 7H2O,0.001%ZnSO4,0.60%colloidal chitin in a 250 mL flask,with the initial pH of 9.5,5.0%inoculum size andculture temperature of 37 益.Under the optimized conditions,the chitinase activity reached
16、(2.72依0.09)U/mL.In conclusion,Acinetobacter sp.WML1 is generally safe in application,with only low toxicity that is preven-table and controllable,and the enzyme activity could be about 4.61 times higher than that before optimiza-tion.The study provides a theoretical foundation for the industrial app
17、lication of chitinase-producing bacteria.Key words:chitinase-producing bacterium;chitinase;Acinetobacter sp.WML1;biosafety;fermentation op-timization(Life Science Research,2023,27(4):361-370)362第 4 期唐白露等:几丁质降解菌 Acinetobacter sp.WML1 的生物安全性和发酵优化糖胺、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-鸟氨酸(上海麦克林生化科技有限公司),抗菌药物药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司
18、),血琼脂平板培养基(江门市凯林贸易有限公司),硝酸还原酶活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。其他试剂均为分析纯。DNS(3,5-dinitrosalicylic acid)试剂按照文献15配制。实验用到的仪器主要有:Hirayama 灭菌器(HVE-50,日本 Hirayama 公司),真空冷冻干燥机(LC-18N-50A,上海力辰邦西仪器科技有限公司),超净工作台SW-CJ-1F(D),苏州真田洁净设备有限公司,生化培养箱(SPX-250,北京中兴伟业仪器有限公司),恒温振荡器(THZ-98C,上海一恒科学仪器有限公司),台式冷冻离心机(Centri-fuge 5417R,德
19、国 Eppendorf 公司),酶标仪(SN:1807235,美国 BioTek 仪器有限公司),HH 恒温水浴锅(KW-1000DC,金坛市中大仪器厂),pH 计(S229,美国梅特勒-托利多仪器有限公司)。1.1.3胶体几丁质的制备按照如下步骤制备胶体几丁质。将 10 g 几丁质加入 200 mL浓盐酸中,充分溶解。28 益、180 r/min振荡约 1.5 h。将红棕色溶液加入 2.5 L 冷蒸馏水中,快速混匀,4 益静置过夜。4 益、5 000 r/min 离心 20 min 收集胶体几丁质,并用冷蒸馏水反复清洗,直至 pH 值大于 5.0。用 200 mL 蒸馏水重悬沉淀,制成胶体几
20、丁质溶液,4 益保存。使用真空冷冻干燥机通过干重法测定胶体几丁质含量(质量体积分数)。1.1.4培养基的制备卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani,LB)液体/固体培养基按照文献16配制。氨基酸脱羧酶测定培养基按照文献17配制。胶体几丁质发酵培养基(质量体积分数,g/mL):0.2%蛋白胨、0.1%葡萄糖、0.2%酵母粉、0.03%KH2PO4、0.07%K2HPO4、0.002%FeSO4、0.05%MgSO4 7H2O、0.001%ZnSO4、0.30%胶体几丁质,蒸馏水配制,pH 7.5,115 益高压蒸气灭菌 30 min。1.2实验方法1.2.1菌株安全性评价采用常规纸片扩散法
21、(Kirby-Bauer 法,K-B法)18进行抗生素敏感性实验,具体方法参考文献19。通过四区划线法于血琼脂平板上划出目标菌株的单菌落,于 28 益培养 2 d,观察菌株周围有无透明溶血环,结果参照 Luis-Villase觛 nor 等20的方法判定。氨基酸脱羧酶活性测定实验和硝酸还原酶活性测定实验参考文献19进行。1.2.2几丁质酶活性的测定分别取 4 滋mol/mL N-乙酰葡糖胺溶液 0、66 滋L、132 滋L、198 滋L、264 滋L、330 滋L、396 滋L、462 滋L、528 滋L、594 滋L、660 滋L 于 1.5 mL 离心管中,用蒸馏水补足至 660 滋L。分
22、别加入 300 滋LDNS 试剂,混匀,于 100 益水浴锅中水浴 10 min,室温冷却 5 min 后,13 000 r/min 离心 5 min,取200 滋L 上清测定 550 nm 处的吸光度(OD550 nm)。以N-乙酰葡糖胺浓度为横坐标,OD550 nm值为纵坐标,绘制标准曲线。取培养 3 d 的发酵液于 2 mL 离心管中,13 000 r/min、4 益离心 5 min,取上清,采用 DNS法进行几丁质酶活性测定。在 660 滋L 溶液中加入1.00%(质量体积分数,g/mL)胶体几丁质,混匀后于 28 益、180 r/min 条件下反应 4 h。随后,按照与绘制标准曲线相
23、同的步骤进行显色并测定 OD550nm。酶活单位(U)定义为在一定条件下,每小时催化产生 1 滋mol 还原糖所需的酶量(mL)。1.2.3菌株产酶条件的优化1.2.3.1培养基成分的优化采用单因素试验法进行无机盐组分(胶体几丁质发酵培养基组、无磷酸盐组、无硫酸盐组和无无机盐组)、碳源(以蔗糖、甘露糖、半乳糖或可溶性淀粉替代葡萄糖)和氮源(以 NH4NO3、KNO3、黄豆粉或鱼粉替代蛋白胨和酵母粉)的优化。在单因素试验的基础上,采用 L16(45)正交表设计 3 因素 4 水平正交试验,对碳源、氮源及胶体几丁质的含量进行优化,正交试验的因素和水平见表 1。培养条件为 28 益、180 r/mi
24、n,250 mL 三角瓶的装液量为50 mL,接种量为 1.0%(体积分数,mL/mL)。1.2.3.2培养条件的优化采用单因素试验法进行初始 pH(7.5、8.5、9.5、10.5)、培养温度(20 益、24 益、28 益、32 益、36 益)、装液量(10 mL、25 mL、50 mL、100 mL、150 mL,采用 250 mL 容量瓶)和接种量(0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%)(体积分数,mL/mL)的优化。在单因素试验的基础上,采用 L16(45)正交表设计 4 因素 4 水平正交试验,对不同培养条件的组合进行优化,正交试验的因素和水平见
25、表 2。1.2.4数据统计分析所有数据用平均值依标准差(x依s)表示。多组间比较采用 SPSS Statistics 17.0 软件进行单因素方差分析,显著水平为 P0.05。采用 Excel 软件进行363生命科学研究圆园23 年图 1Acinetobacter sp.WML1 溶血性检测结果Fig.1Hemolytic results of Acinetobacter sp.WML1表 2培养条件正交试验的因素及水平表Table 2Factors and levels in orthogonal experiment for optimizing culture conditions表 1
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