基于网络药理学探讨化浊行血汤抗高脂血症的作用机制.pdf
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1、天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9基于网络药理学探讨化浊行血汤抗高脂血症的作用机制*席加秋1,邵玉泽1,王中琳1,2(1.山东中医药大学,济南250355;2.山东中医药大学附属医院,济南250355)摘要:目的基于网络药理学探讨化浊行血汤抗高脂血症的作用机制。方法通过高脂饲料喂养8周构建高脂血症大鼠模型。将大鼠分为对照组、模型组、化浊行血汤高剂量组、化浊行血汤中剂量组、化浊行血汤低剂量组、辛伐他汀组。灌胃8周后检测大鼠体质量、肝湿质量、肝指数以及血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量,苏木精
2、-伊红(HE)染色观察大鼠肝脏组织学变化。借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及中药分子机制生物信息分析工具(BATMAN-TCM)筛选化浊行血汤的活性成分及相关靶点。借助药物银行(Drugbank)、疾病相关基因与突变位点数据库(DisGeNET)、比较毒理基因组数据库(CTD)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM)及遗传关联数据库(GAD)查询高脂血症相关靶点。获取化浊行血汤及高脂血症交集靶点,在Cytoscape3.7.2中构建成分-靶点网络。将交集靶点导入String数据库获取蛋白互作(PPI)网络,对PPI网络进行拓扑分析获取关键靶点。将交集靶点导入基因注释形象集成数据库(D
3、AVID)进行基因本体(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。实时荧光定量聚合酶链式反应法(RT-PCR)测定关键靶点mRNA表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠肝指数升高(P0.05),肝脂肪变性明显,血清TC,TG及LDL-C水平显著升高(P0.05)。与模型组比较,化浊行血汤各组大鼠肝指数降低(P0.05),肝脂肪变性明显改善,血清TC,TG及LDL-C含量降低(P0.05),化浊行血汤高中剂量组HDL-C含量升高(P0.05)。筛选获取化浊行血汤56个生物活性成分及327个靶点,高脂血症148个靶点。化浊行血汤与高脂血症交集靶点37个,涉及化浊行血汤37个生物活性成分
4、,包括槲皮素、藏花酸、山柰酚、豆甾醇等。筛选获得胰岛素(INS)、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ABCA1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARA)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、脂联素(ADIPOQ)、载脂蛋白A2(APOA2)等15个关键靶点。富集分析预测化浊行血汤抗高脂血症可能涉及PPAR、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信号通路。选取PPAR信号通路上的关键靶点脂联素受体2(AdipoR2)、PPAR及APOA2进行实验验证。与对照组比较,模型组AdipoR2和PPAR mRNA表达水平下调(P0.05)。与模型组比较,化浊行
5、血汤高剂量组AdipoR2 mRNA表达水平上调(P0.05),化浊行血汤高中剂量组PPAR mRNA表达水平上调(P0.05),化浊行血汤高中剂量组APOA2 mRNA表达水平下调(P0.05)。结论化浊行血汤能够改善高脂血症大鼠脂代谢紊乱,减轻脂质沉积,其抗高脂血症的机制可能与干预AdipoR2/PPAR/APOA2信号通路有关。关键词:网络药理学;化浊行血汤;高脂血症;作用机制中图分类号:R972.6文献标志码:A文章编号:1672-1519(2023)09-1190-10开放科学(资源服务)标识码(OSID):DOI:10.11656/j.issn.1672-1519.2023.09.
6、17*基金项目:山东省中医药科技项目(2020M004);齐鲁内科血浊学术流派传承工作室(鲁财社指202118号);山东省中医药科技发展计划项目(2019-0108)。作者简介:席加秋(1968-),女,副主任技师,从事临床医学检验工作。通讯作者:王中琳,E-mail:wzl_。引用格式:席加秋,邵玉泽,王中琳.基于网络药理学探讨化浊行血汤抗高脂血症的作用机制J.天津中医药,2023,40(9):1190-1199.高脂血症以总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高,和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低为特征1。高脂血症能够引发复杂的血管病变。在经过血管内
7、皮损伤、脂质沉积、平滑肌细胞增生等病理环节后,血管壁逐渐增厚、狭窄,失去其应有弹性,引发高血压、冠心病、心肌梗死、脑梗死等多种心脑血管疾病。心脑血管疾病造成了沉重的社会经济负担,成为人类主要死亡原因之一2-3。因此,对高脂血症进行有效干预是防治心脑血管疾病的重要举措。目前,他汀类药物被推荐为一线降脂药4。但不容忽视的是,越来越多的证据表明,他汀药物在降脂的同时能够引发肌痛、1190天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9横纹肌溶解、肝肾毒性等严重不良反应5-6。鉴于目前治疗方法的局限性,寻找天然、有效的补充或替代策略逐渐成为治疗高脂血症的关注重点。王新陆教授在 脑血辨
8、证 一书中首次提出了“血浊”的概念。血浊指血液受各种因素影响,失去其清纯状态,或丧失其循行规律,影响脏腑气机的病理现象,与高脂血症的特点相契合7-8。王新陆教授认为,运气不同,古今异轨,现代疾病谱的构成已由过去感染、营养不良等单因素疾病为主转变为以机体自身代谢和调控失常导致的慢性非传染性疾病为主。后者也被称为“现代生活方式病”,由精神压力增加,过食肥甘厚味,劳逸失度等因素诱发,与当今物质文明飞速发展息息相关。“血浊”正是在这一新的时代背景下应运而生的概念。对血浊状态的干预能够将心脑血管疾病的治疗方向前移到“治未病”层面,若及渴而穿井,斗而铸锥,则治疗难度增大,且易出现后遗症状。因此,在血浊学术
9、理论的指导下,王新陆教授创制了治疗高脂血症的化浊行血汤。化浊行血汤由荷叶、焦山楂、决明子、赤芍、酒大黄、路路通、虎杖、何首乌、水蛭粉9味中药组成。方中荷叶、决明子、焦山楂功善清化浊邪而无耗血伤阴之弊,共为君药。水蛭粉、酒大黄、赤芍通行血脉,善消坚积,助君药清化血浊,共为臣药。路路通利水除浊,兼通经活络,虎杖活血化浊,兼清血浊内郁之热,何首乌消脂通便,兼补浊邪内耗之阴血,共为佐药。诸药合用,共奏化浊消脂,行血畅血之功。前期临床研究已证明,化浊行血汤能够有效降低高脂血症患者的血脂水平,且未出现明显的毒副作用9。目前,化浊行血汤抗高脂血症的作用机制尚未阐明,故本研究拟借助网络药理学方法对其潜在机制进
10、行科学预测,并对预测结果进行实验验证,以期为深入探究化浊行血汤抗高脂血症的作用机制提供基础实验依据。1材料与方法1.1实验动物SPF级健康雄性SD大鼠60只,6周龄,体质量(18020)g,购于济南朋悦实验动物有限公司,实验动物合格证号:SCXK(鲁)20190003。SD大鼠饲养于山东中医药大学附属医院动物实验中心,室内保持12 h昼夜节律,温度(252),自由摄食饮水。本研究通过山东中医药大学附属医院伦理委员会审批,审查编号:AWE-2019-042。1.2药物及试剂化浊行血汤:荷叶15 g,焦山楂10 g,决明子15 g,赤芍10 g,酒大黄10 g,路路通10 g,虎杖10 g,何首乌
11、10 g,水蛭粉3 g,以上药物浸泡30 min,武火煮沸,文火煎煮20 min后取滤液,加水继煮15 min后再取滤液,两次滤液合并,浓缩成质量浓度为4 g/mL的化浊行血汤水煎液,存于4 冰箱备用(山东省中医院药剂科),辛伐他汀片20 mg/片(杭州默沙东制药有限公司),高脂饲料:猪油10%,蛋黄粉10%,胆固醇1%,胆酸盐0.2%,基础饲料78.8%(山东百朋生物科技有限公司),TG、TC、LDL-C、HDL-C试剂盒(山东赛恩斯生物科技有限公司),苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司),TaKaRa MiniBEST UniversalRNA Extraction
12、 Kit(TaKaRa,No.9767),Evo M-MLVRT Kit with gDNA Clean for qPCR(ACCURATE,No.AG11711),SYBR Green Premix Pro TaqHS qPCRKit(ACCURATE,No.AG11701)。1.3实验仪器轮转式切片机(Leica,德国),荧光倒置显微镜(Leica,德国),PRONTO EVOLUTION全自动生化分析仪(BPC Bio Sed,意大利),Nano Drop2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific,美国),Light Cycler 480 Real-time P
13、CR仪(Roche,瑞士)。1.4动物分组与给药适应性喂养1周后,按体质量随机分为对照组、模型组、化浊行血汤高剂量组、化浊行血汤中剂量组、化浊行血汤低剂量组、辛伐他汀组,每组10只。对照组予普通饲料喂养,其余组给予高脂饲料喂养。8周后目内眦静脉丛取血,测得受试动物血中TC、TG、LDL-C显著升高,确定高脂血症模型复制成功。根据 药理实验方法学 中的不同种类受试对象剂量换算方法,查询人与大鼠间剂量换算系数及校正系数,计算得出180 g大鼠每日用药剂量是标准体质量成人每日用药剂量的5.8倍10,故化浊行血汤高、中、低剂量组每日给药剂量分别为18、9、4.5g/kg,辛伐他汀组每日给药剂量为4mg
14、/kg,对照组和模型组予等体积生理盐水5 mL/kg。连续灌胃8周,每日1次。1.5体质量、肝湿质量、肝指数测定每两周测定1次大鼠体质量。末次给药后,禁食不禁水12 h,予40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。腹主动脉取血8 mL,并在冰上迅速分离肝组织,使用预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗,滤纸吸取多余水分,称取肝脏湿质量。称量完毕后分装速冻,存于-80 冰箱备用。肝指数=肝湿质量/体质量100%。1.6HE染色取部分分离的肝组织于4%多聚甲醛中固定,脱水包埋后将组织切片,厚度为5 m,对1191天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 1RT-PCR 引物序列
15、Tab.1Primer sequence used for RT-PCR analysis引物正向引物(5-3)反向引物(5-3)AdipoR2TCAGAGCAGGAGTGTTCGTGAGCCAGCCTATCTGCCCTATPPARACGATGCTGTCCTCCTTGATGAAC ATGATGTCGCAGAATGGCTTCCTCAPOA2CAGAGATTCAGAACCAAGCCAAGG AGTCCATCAGATTCGTCCCAGTTGADPHGCGGGAGCGGATCCTAATATGGTGCATCCATGGGCTAC表 2化浊行血汤对高脂血症大鼠体质量、肝湿质量、肝指数的影响(xs)Tab.2
16、Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on weight,hepatic wet weight,and liver index in hyperlipidemiarats(xs)组别动物数剂量(g/kg)体质量(g)肝湿质量(g)肝指数(%)对照组10-471.2061.1110.181.312.090.17模型组10-526.4032.5414.071.50*2.670.15*辛伐他汀组10210-3479.7066.9510.881.152.290.24化浊行血汤组1018.0458.7034.4510.641.422.320.25109.0476.203
17、6.2111.221.382.350.15104.5492.1066.7511.470.542.360.29注:与对照组比较,*P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01。切片进行脱蜡水化处理,进行HE染色,脱水封片,光镜下观察肝脏的组织学变化。1.7血清生化指标检测采用全自动生化分析仪,严格按试剂盒说明检测血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。1.8化浊行血汤成分筛选及靶点预测应用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http:/ 类 药 性DL 0.18;BATMAN-TCM数据库筛选条件设置为截断值20,P0.05。应用通用蛋白质资源库(UniProt,https:/w
18、ww.uniprot.org)对靶点蛋白名进行规范化处理。1.9高脂血症靶点预测以“高脂血症”为检索词,应用药物银行(Drugbank,https:/www.drugbank.ca)、疾病相关基因与突变位点数据库(DisGeNET,https:/www.disgenet.org)、比较毒理基因组数据库(CTD,http:/ctdbase.org)、人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https:/omim.org)及遗传关联数据库(GAD,https:/geneticassociationdb.nih.gov)查找高脂血症相关靶点。应用UniProt数据库对靶点蛋白名进行规范化处理。1.10化浊行
19、血汤抗高脂血症的成分-靶点网络及蛋白互作(PPI)网络构建首先,借助TBtools v0.5确定化浊行血汤与高脂血症的交集靶点,交集靶点即为化浊行血汤抗高脂血症的潜在靶点。查找交集靶点所对应化浊行血汤的活性成分,构建化浊行血汤抗高脂血症的成分-靶点网络。将交集靶点导入STRING数据库(https:/string-db.org/)构建PPI网络,并借助Cytoscape3.7.2插件cytoHubba拓扑化浊行血汤抗高脂血症的关键靶点。1.11基因本体(GO)与京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析将化浊行血汤抗高脂血症的交集靶点导入基因注释形象集成数据库(DAVID,https:/da
20、vid.ncifcrf.gov),设置背景基因为“Homosapiens”,P0.05。利用R语言工具包绘制生物过程、细胞组分、分子功能条形图及通路高级气泡图。1.12RT-PCR检测对肝组织样本使用液氮研磨,使用Buffer RL进行裂解,按说明书要求提取总RNA,测定总RNA浓度及完整性。将总RNA按说明书要求,使用M-MLV RTase Enzyme MIX逆转录为cDNA。将cDNA按说明书要求,使用2SYBRGreen Pro Taq HS Premix进行PCR扩增。反应条件:预变性95 30 s(1个循环);定量分析95 5 s,60 30 s(40个循环);溶解曲线采集95 5
21、 s,60 60 s,95 酶瞬间灭活(1个循环);冷却40 30 s(1个循环)。以GAPDH为内参基因,采用2-Ct法计算目的基因的相对表达量。引物由山东赛恩斯生物科技有限公司设计合成,引物序列见表1。1.13统计学方法应用SPSS 23.0进行统计分析。计量资料采用均数标准差(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。P0.05)。与对照组比较,模型组大鼠肝湿质量和肝指数升高(P0.01)。与模型组比较,辛伐他汀与化浊行血汤各剂量组均能降低高脂血症大鼠肝湿质量和肝指数(P0.05或P0.01)。见表2。2.2化浊行血汤对高脂血症大鼠血脂水平的影响与对照组比
22、较,模型组大鼠TC,TG及LDL-C水平升高(P 0.01),HDL-C水平差异无统计学意义1192天 津 中 医 药 23年9月第40卷第9期Sep.23,40 9表 3化浊行血汤对高脂血症大鼠血脂水平的影响(xs)Tab.3Effect of Huazhuo Xingxue Decoction on lipid levels in hyperlipidemia rats(xs)组别动物数剂量(g/kg)TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)对照组10-0.970.070.530.160.330.030.970.18模型组10-1.610
23、.03*1.940.16*0.670.03*0.850.11辛伐他汀组10210-31.100.090.890.150.430.040.800.09化浊行血汤组1018.01.160.060.860.080.510.051.210.03#109.01.240.051.000.200.490.081.120.03#104.51.380.07#1.200.070.530.071.020.08注:与对照组比较,*P0.01;与模型组比较,P0.05,P0.01;与辛伐他汀组比较,#P0.05)。与模型组比较,辛伐他汀与化浊行血汤各剂量组均能降低高脂血症大鼠TC,TG及LDL-C水平,高中剂量化浊行血
24、汤能够升高大鼠HDL-C水平(P0.05或P 0.01)。以上结果表明高中剂量化浊行血汤的降脂作用与辛伐他汀疗效相当(表3)。2.3化浊行血汤对高脂血症大鼠肝脏病理形态学的影响HE染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肝小叶结构紊乱,肝窦缺失,肝细胞肿胀变性,内部可见脂肪滴沉积,部分细胞核因脂滴挤压而发生偏位。与模型组相比,化浊行血汤各剂量组和辛伐他汀组肝脏组织结构排列较整齐,脂肪变性明显减轻(图1)。2.4化浊行血汤成分筛选及靶点预测化浊行血汤各中药符合TCMSP数据库及BATMAN-TCM数据库筛选条件的化学成分及相关靶点数目如下:山楂2个化学成分涉及25个作用靶点,荷叶15个化学成分涉及
25、430个作用靶点,决明子14个化学成分涉及231个作用靶点,赤芍29个化学成分涉及218个作用靶点,大黄16个化学成分涉及183个作用靶点,水蛭1个化学成分涉及171个作用靶点,虎杖10个化学成分涉及294个作用靶点,路路通4个化学成分涉及110个作用靶点,何首乌1个化学成分涉及14个作用靶点。经去重处理后,化浊行血汤全方共涉及56种化学成分,327个作用靶点。2.5高脂血症靶点预测在各疾病数据库分别检索得到高脂血症靶点数目如下:Drugbank29个、DisGeNET19个、CTD33个、OMIM50个、GAD72个。经去重处理后,共获取148个高脂血症作用靶点。2.6化浊行血汤抗高脂血症的
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