基于网络药理学和细胞实验探讨独活—牛膝治疗骨关节炎的作用机制.pdf
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1、 基金项目:南通市科技局指导性项目(JCZ20195)通信作者,E-mail:18851413676 mlt11095779 基于网络药理学和细胞实验探讨独活牛膝治疗骨关节炎的作用机制庄耀隆1,闵令田2(1.南京中医药大学附属苏州市中医医院,江苏 苏州 215009;2.南京中医药大学附属南通市中医院,江苏 南通 226000)摘要:目目的的 探讨独活和牛膝治疗骨性关节炎(OA)的作用机制。方方法法 通过网络药理学获得了 OA 相关靶标,构建了中药活性成分蛋白网络、蛋白蛋白互作网络和核心基因网络,并对筛选得到的核心基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)功能分析。细胞实验采用白细胞介素-1
2、(IL-1)诱导的 OA 细胞模型,采用CCK8 检测药物对于细胞活力的影响,Western blot 及 RT-PCR 检测通路蛋白及基因的表达。结结果果独活牛膝药对共得到 14 个活性化合物和 35 个潜在 OA 靶点,15 个核心基因。其中血管内皮生长因子 A(VEGFA)-肿瘤蛋白 53(TP53)是独活牛膝的网络和通路中的重要节点,也是可能是独活牛膝治疗骨性关节炎的关键通路。另外,通过人类 OA 样本的转录组数据分析表明,VEGFA 和 TP53 在 OA 患者软骨中显著降低,同时 2 个基因相关性显著。IL-1 诱导的 OA 细胞模型表明独活牛膝可以显著激活 VEGFA-TP53
3、通路,同时显著降低 MMP13 基因和蛋白表达并上调 collagen 的基因和蛋白表达。结结论论 独活牛膝可能主要通过上调 VEGFA-TP53 通路从而影响其他多条通路,降低了 OA 发展过程中的关键蛋白,从而发挥其抗 OA 的功效。关键词:网络药理学;体外实验;牛膝;骨性关节炎;血管内皮生长因子 A;肿瘤蛋白 53 中图分类号:R593.22 文献标志码:A 文章编号:2096-3882(2023)09-0650-07DOI:10.3969/j.issn.2096-3882.2023.09.005Mechanism of Achranthis Bioentatae Radix-Angel
4、icae Pubescentis Radix in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and molecular dockingZHUANG Yaolong1,MIN Lingtian2(1.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing University of Chinese Medicine,Suzhou,Jiangsu 215009,China;2.Nantong Hospital of Traditional Chinese Me
5、dicine,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing University of Chinese Medicine,Nantong,Jiangsu 226000)Abstract:Objective To explore the mechanism of Achranthis Bioentatae Radix(AB)and Angelicae Pubescentis Radix(AP)in the treatment of osteoarthritis(OA).Methods In this study,the OA-related tar
6、gets were screened out through network pharmacology.Then,a traditional Chinese medicine-active ingredient-protein network,a protein-pro-tein interaction network and a core gene network were established.The resultant core genes were applied for KEGG func-tion analysis.Furthermore,an interleukin(IL)-1
7、-induced model of OA cells was constructed.Cell viability was de-tected by CCK-8 assay.The expression of signaling proteins and gens were detected by Western blot and RT-PCR.Re-sults A total of 14 active compounds,35 potential OA targets,and 15 core genes were obtained from the drug pair of AB-AP.Am
8、ong them,vascular endothelial growth factor A(VEGFA)and tumor protein 53(TP53)were important nodes in the network and pathways of AB-AP,and might also be a key pathway for AB-AP to treat OA.Furthermore,the transcriptome data analysis of human OA samples showed that VEGFA and TP53 significantly decre
9、ased in the carti-lage of OA patients,and the two genes were significantly correlated.The IL-1-induced OA cell model showed that AB-AP significantly activated the VEGFA-TP53 pathway,while significantly reducing the gene and protein expression of 056徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2023,43(9)MMP13 and up-r
10、egulating collagen gene and protein expression.Conclusions AB-AP may mainly up-regulate the VEGFA-TP53 pathway,in order to affect other multiple pathways,reduce the key proteins in the development of OA,and exert its anti-OA effect.Key words:network pharmacology;Achranthis Bioentatae Radix;Angelicae
11、 Pubescentis Radix;osteoarthritis;vas-cular endothelial growth factor A;tumor protein 53 骨关节炎(OA)是一种普遍流行的与年龄相关的进行性关节疾病,其特征是关节软骨变性、骨增生形成和功能障碍,关节软骨的病变可能导致肿胀、疼痛、骨增生,甚至运动功能障碍1-4。随着人们预期寿命的增长,OA 已逐渐成为最广泛的慢性疾病之一,导致老年人身体残障,生活质量下降5。目前OA 的治疗集中在缓解疼痛上,包括口服非甾体类抗炎药(NSAID)以及关节内注射透明质酸和类固醇。在疾病晚期,目前的治疗策略是关节置换手术6-9。因此
12、,目前尚无有效的骨关节炎疾病缓解疗法,迫切需要一种缓解 OA 药物(DMOAD)来减轻或逆转 OA 的发展10。中医药由于效果明显,不良反应较少的优点得到了越来越多的关注。独活寄生汤由独活、桑寄生、牛膝等 15 味中药组成,具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血功效11。临床广泛应用于 OA12-13、类风湿关节炎14等多种病症。独活为独活寄生汤中的君药,它可以祛下焦与筋骨间的风寒湿邪,而牛膝尚能活血以通利肢节筋脉,从而辅佐独活的药效。而 2 种中药相互配伍的治疗机制尚不能解释清楚,其中的活性化合物也未明确。网络药理学利用计算机模拟计算和拓扑学从整体角度和单个化学成分角度出发,解释了中药汤剂的多靶
13、点、多通路治疗机制。本研究基于网络药理学和细胞学实验,探究独活牛膝的有效成分和治疗 OA 的关键靶点和通路。1 材料和方法1.1材料细胞计数试剂盒(CCK-8)购自 Beyo-time(C0038,Beyotime,中国);MMP 13 和 collagen 的抗体购自 Affinity(DF6494,AF0135,Affinity,美国),独活和牛膝购买自北京同仁堂(集团)有限公司(中国)。1.2 药材提取 称取独活 100 g、牛膝 100 g,另称取独活 50g 和牛膝 50 克准备混合提取,分别向 3 份药材中加入 1 000 ml 水煎煮 0.5 h 后,过滤,再分别向残渣中加入 8
14、00 ml 水煎煮 0.5 h 后,分别合并 2次滤液,浓缩干燥后分别得到独活提取物(AB)、牛膝提取物(AP)和独活牛膝提取物(AB&AP)。1.3 独活牛膝活性成分和作用靶标筛选利用Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP,http:/ 2 味药材的活性成分和相应的作用靶点,选取口服生物利用度(OB)30%和药物相似性(DL)0.18 的化合物作为活性成分,同时在该数据库获取活性成分的作用靶标。1.4 OA 疾病靶标筛选利用 Genecard(https:/w
15、ww.genecards.org)和 OMIM(https:/www.omim.org)数据库获取与 OA 相关的疾病靶标并进行整合,建立 OA 疾病靶点数据库。利用该数据库筛选出药对中活性成分的作用靶标中与 OA 疾病相关的靶点。1.5 网络构建将独活牛膝中活性成分的 OA靶标导入 String(https:/string-db.org)数据库,建立蛋白质相互作用网络(PPI)。利用 Cytoscape 3.6.0 软件对药物、活性成分、作用靶标、作用通路进行拓扑学分析,利用 Cytohubba 中的 MCC 算法计算 PPI 网络的核心基因。1.6 KEGG 通路富集分析 利用 Bioco
16、nductor 数据库对 PPI 网络中分析得到的 15 个核心基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集,筛选 P 0.05)。1.9 细胞培养SW1353 细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。SW1353 细胞在含10%胎牛血清(FBS)的 Hams F 12 培养基(F 12)中培养。在含 10%FBS 的 2 ml F12 中,将 SW1353 细胞一式三份以每孔 3105个细胞的浓度培养(6 孔细胞板)。将白细胞介素-1(IL-1)(10 g/L)和(或)独活提取物、牛膝提取物、独活牛膝提取物加入指数生长期细胞中,培养 48 h,用于 mRNA和 Western
17、blot 检测。1.10RT-PCR 实验使用 Trizol 试剂(15596,In-vitrogen,美国)从 SW1353 细胞或中收集总 RNA。使用实时 PCR 评估基因表达水平。SYBR Green PCR Master Mix(Q131-02,Vazyme)用于定量基因表达水平。GAPDH 的基因表达水平作为内源性对照,使用2-CT方法来计算相对倍数变化。1.11 Western blot 实验 从 SW1353 细胞中提取总蛋白,使用 8%12%SDS-PAGE 分离,转移到PVDF 膜上,一抗、4 下过夜,二抗、室温下 2 h。使用 ECL 试剂(P0018S,Beyotime
18、,中国)显膜。1.12 统计学处理 所有实验均独立进行并重复至少 3 次。所有数据均采用单向或双向方差分析进行分析。实验的所有数据均通过均值标准误给出。P0.4),并通过 Cytoscape 3.6 建立蛋白质蛋白质相互作用网络。PPI 网络中总共获得了35 个节点。网络的聚类系数为 0.658。Cytoscape 中的 Cytohubba插件用于计算 PPI 网络中的核心基因。在研究中,拓扑中的 MCC 算法用于选择度值前 15 个 PPI 网络中的目标点作为核心基因。其中 VEGFA、TP53、转化生长因子 B1(TGFB1)、肿瘤坏死因子(TNF)、IL6等的度值明显较高。这些基因可能是
19、独活寄生汤治疗 OA 过程中的关键靶点。从核心基因网络中的蛋白相互关系中可以发现,VEGFA-TP53 的相互作用处于整个网络的关键位置。2.3 独活牛膝药 KEGG 通路分析利用 KEGG通路分析进一步分析独活牛膝对 OA 的作用机制。按照 FDR 值将 15 个核心基因在 bioconductor富集得到的 30 条通路排序。通路中包括 AGE-RAGE、IL17、MAPK、TNF 等多条炎症关节炎相关通路,进一步证明独活牛膝可以通过多条通路缓解OA。为了进一步探究通路和独活牛膝潜在的靶标关系,用以阐释独活牛膝的作用机理,建立靶标通路网络图。分析网络发现,VEGFA 和 TP53影响的通路
20、较为相似,这表明 VEGFA 和 TP53 对OA 的影响具有相似性,推测 VEGFA 和 TP53 可能存在上下游关系。2.4 基于分子对接验证独活、牛膝中的化合物与VEGFA 和 TR53 的结合通过通路分析发现 VEG-FA 和 TP53 是治疗机制中的关键靶点。为进一步验证结果,本研究采用 autodock vina 将作用独活和牛膝中的 14 个活性成分与 VEGFA 和 TP53 蛋白晶体(PDB:2VGH&2WTT)进行分子对接,对接结果如图 1 A-E。对接结果表明,14 个活性成分均能与VEGFA 和 TP53 结合产生较低结合能。其中分别来自独活和牛膝的化合物 Angelo
21、l D 和 Baicalin 具有更低的整体结合能。由此也可以证明独活和牛膝协同影响了 VEGFA 和 TP53。2.5 基于 IL-1 诱导细胞模型探究独活、牛膝和独活牛膝配伍的抗 OA 药效 为了进一步评价独活、牛膝单味药和两者配伍的药效,本实验建立了基于 IL-1 诱导的人软骨细胞(SW1353)关节炎模型,以 MMP 13 和 collagen 的基因和蛋白表达为指标,评价独活牛膝的抗 OA 药效。独活提取物(AB)、牛膝提取物(AP)、独活牛膝提取物(AB-AP)在 50 mg/L 的给药剂量时均不影响 SW1353 细胞的细胞活力(图 2A-C)。因此,我们确定了 3 种提取物的细
22、胞给药剂量均为 50 mg/L。结果显示,256徐州医科大学学报 J Xuzhou Med Univ 2023,43(9)与对照组相比,模型组中 IL-1 可以显著上调MMP13 并下调胶原的蛋白表达水平。3 种提取物均可以上调胶原的基因表达、下调 MMP13 的蛋白表达,其中独活牛膝提取物的效果最为明显(图 2D-F)。mRNA 的结果也显示出相同的结果(图2G-H)。上述结果表明,独活、牛膝和独活牛膝提取物均可以通过调节 MMP 13 和型胶原蛋白的基因表达来延缓 ECM 的降解,而其中独活牛膝配伍后具有更好的抗 OA 作用。2.6独活、牛膝和独活牛膝对 VEGFA 和 TP53的 mRN
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