基于发根农杆菌的大豆CRISPR_Cas9系统靶点可行性的快速检测方法.pdf
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1、56Journal of Agricultural Catastrophology 2023,Vol.13 No.7基于发根农杆菌的大豆 CRISPR/Cas9 系统靶点可行性的快速检测方法罗 可,王 珞,刘 辉*贵州省农业科学院 生物技术研究所/贵州省农业生物技术重点实验室,贵州贵阳 550009摘要 研究选取大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因为靶标,使用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建靶点的基因敲除载体,并利用发根农杆菌K599的特性侵染大豆植株,以获取不定根,通过对不定根的DNA提取和PCR测序鉴定,发现靶点前的序列峰图平稳且准确,在靶点处开始出现杂乱的套峰,表明大豆FAD2-
2、1A与FAD2-1B2个基因均被成功编辑。此方法操作简单、实验周期较短,实现了对大豆中选择靶点的可行性的快速鉴定,为研究大豆的FAD2基因功能和遗传改良方面提供了新的技术支持。关键词 CRISPR/Cas9;大豆;发根农杆菌;基因编辑中图分类号:S565.1 文献标识码:B 文章编号:20953305(2023)070056-03大豆是世界上主要的油料作物之一,能够为人类和动物提供丰富的蛋白质和油脂1。随着大豆基因组测序工作的完成,以及基因组学、生物技术的快速发展,从基因层面通过分子育种从而培育新的大豆品种成为重要的研究方向。基因组编辑技术又被称为靶标基因工程,它通过编辑特定的基因、敲除基因、
3、引起特异位点突变等方式修饰基因,是研究植物基因功能的重要方法之一2。种子中的油脂和蛋白质含量是油料作物大豆品质的重要评价标准3,利用基因编辑技术对大豆相关基因进行靶向修饰,通过研究大豆中油脂和蛋白质合成途径相关功能基因,可进一步培育得到高油酸、高品质的大豆。近年来,尽管基因组编辑技术在大豆中得到了迅速应用,然而相对于水稻、拟南芥等植物的研究,大豆基因编辑技术的应用仍处于发展缓慢阶段。CRISPR/Cas9技术在大豆的应用有以下问题面临解决:首先,适合大豆基因编辑技术的系统研究发展缓慢,大豆整体基因编辑效率维持在10%左右,与基因编辑效率达到80%的水稻等植物相比,存在着巨大差距4。不仅如此,大
4、豆遗传转化效率低会影响阳性编辑体的植物的获得;目前大多都采用农杆菌介导的大豆遗传转化体系,虽该体系经过改良和优化,但遗传转化率仍不理想,也大大降低了基因编辑技术在大豆改良上的进一步应用。因此,在遗传转化前验证基因功能编辑靶点的可行性显得尤为重要。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性的土壤杆菌,属于根瘤菌科5,在其侵染植株后,能够诱导植株产生大量高度分支的不定根。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了用于敲除大豆基因的载体,并通过发根农杆菌介导的方法使大豆产生不定根,以验证FAD2基因上编辑靶点的可行性,为大豆基因组编辑和基因功能的验证奠定基础。1
5、材料与方法1.1 实验材料与试剂植物材料大豆品种为黑河43,基因编辑载体PBSE401与中间载体购自BIOSCI生物公司;大肠杆菌E.coli A Rapid Detection Method for the Feasibility of Soybean CRISPR/Cas9 System Targets Based on Agrobacterium rhizogenesLuo Ke et al(Biotechnology Research Institute,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Agricul
6、tural Biotechnology of Guizhou Province,Guiyang,Guizhou 550009)Abstract The CRISPR/Cas9 gene editing method was used in this study to create gene knockout vectors for the soybean FAD2-1A and FAD2-1B genes.Agrobacterium rhizogenes K599 was then used to infect soybean plants and produce adventitious r
7、oots.The adventitious roots DNA was extracted,and PCR sequencing revealed that the adventitious roots sequence peaks were smooth and accurate before the target,and chaotic overlaid peaks started to develop near the target,showing that the soybeans FAD2-1A and FAD2-1B genes had been successfully alte
8、red.This approach offered novel technical assistance for the investigation of the FAD2 gene function and genetic advancement in soybeans.It was straight forward to use,has a brief experimental cycle,and enables rapid identification of the viability of target selection in soybeans.Key words CRISPR/Ca
9、s9;Soybean;Agrobacterium rhizogenes;Gene editing作者简介 罗可(1995),男,贵州六盘水人,研究实习员,主要从事植物病理研究。*通信作者:刘辉(1986),男,江西宁都人,副研究员,主要从事植物保护研究,E-mail:。收稿日期 2023-05-0257农业灾害研究 2023,13(7)DH5购自Biomed 生物公司,发根农杆菌K599购自上海唯地生物技术有限公司。DNA纯化回收试剂盒和质粒提取试剂盒(TIANGEN生物公司);Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司;限
10、制性内切酶Bsa、T4 DNA Ligase购 于New England Biolabs(NEB)有限公司;DNA提取试剂盒、引物合成及测序来自生工生物工程(上海)股份有限公司。1.2 实验方法1.2.1 靶点选择通过CRISPR靶点序列在线设计工具CRISPOR设计FAD2-1A、FAD2-1B基 因 的 敲 除 靶 点,该工具能够在输入序列中找出所有的CRISPR/Cas9靶位点,基于GC含量与二级结构最终选取靶点T3与T28设计sgRNA,sgRNA扩增引物及鉴定引物详见表1。表1 引物序列引物名称引物序列(5-3)备注FAD2-DT1-BsFATATATGGTCTCGATTGTGGGT
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