基于Nrf2_HO-1信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响.pdf
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1、第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2022-03-28基金项目:河北省医学科学研究课题(20200260)作者简介:郭伟(1973),男,副主任医师,研究方向:大肠肛门常见病多发病.E-mail:mrvi7873 基于 Nrf2/HO-1 信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响郭 伟1 闫丽霞1 常少青2 刘振丽2(1.保定市第二医院 肛肠科,保定071050)(2.河北省第七医院 影像科,保定073000)摘要:目的观察黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成和 Nrf2/HO-
2、1 信号通路的影响。方法将 20 只 SPF 级 SD 大鼠进行综合法构建肛瘘术后创面模型,建模成功后随机分为模型组和黛玉膏组,每组 10 只。黛玉膏组大鼠使用药物涂抹伤口,模型组以 0.9%氯化钠溶液擦洗。另选取 10 只仅造成创口的大鼠作为对照组,也以 0.9%氯化钠溶液擦洗,各组大鼠每天处理 2 次,均连续干预 14 d。观察创面愈合情况及局部血流。ELISA 法检测肛瘘创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF 受体(VEGFR)、内皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白细胞介素 IL-1、IL-6、IL-10、大鼠肿瘤坏死因子(TNF-)水平;Western b
3、lot 法检测创面组织 Nrf2 及 HO-1 蛋白水平。结果与对照组相比,模型组创面愈合率及血流量显著下降(P0.05),与模型组相比黛玉膏组大鼠创面愈合率和血流量显著升高(P0.05);CD31 染色结果比较,模型组较对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05);肉芽组织 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-比较,模型组较对照组显著升高(P0.05),黛玉膏组较模型组显著降低(P0.05);肉芽组织 VEGF、VEGFR、EGF、PDGF 比较,模型组较对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05);Nrf2、HO-1 蛋白水平比较,模型组较
4、对照组显著降低(P0.05),黛玉膏组较模型组显著升高(P0.05)。结论黛玉膏可以促进肛瘘模型大鼠创面的愈合,促进肉芽组织的血管新生,其机制可能与激活 Nrf2/HO-1 通路有关。关键词:Nrf2;肛瘘;血管新生;黛玉膏;HO-1中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0017-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.004Effect of Daiyu Ointment on Angiogenesis in Rats with AnalFistula via Nrf2/HO-1 Signal PathwayG
5、UO Wei1,YAN Lixia1,CHANG Shaoqing2,LIU Zhenli2(1.Department of Proctology,Baoding Second Hospital,Baoding 071050,China)(2.Department of Imaging,Seventh Hospital of Hebei Province,Baoding 073000,China)Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Daiyu ointment on angiogenesis and Nrf2/HO-1 signaling pa
6、thway in rats with anal fistula.Method 20 SPF-grade SD rats were constructed a post-operative wound model of fistula by comprehensive method,after successful modeling,they were randomly divided into model group and Daiyu paste group,with 10 rats in each group.Rats in the Daiyu paste group applied th
7、e wound with drugs,and the model group scrubbed with 0.9%sodium chloride solution.In addition,10 rats with only wounds were selected as the control group,and scrubbed with 0.9%sodium chloride solution,and the rats in each group were treated twice a day,all of which were continuously intervened for 1
8、4 days.then the wound healing and local blood flow was observed.Then the rats were sacrificed.实验动物科学40 卷ELISA was used to detect the levels of vascular endothelial growth factor(VEGF),VEGF receptor(VEGFR),epidermal growth factor(EGF),platelet derived growth factor(PDGF),interleukin(IL)-1,IL-6,IL-10,
9、tumor necrosis factor (TNF-)in wound tissues of anal fistula;Western blot was used to detect the protein levels of Nrf2 and HO-1 in the wound tissues.ResultCompared with the control group,the wound healing rate and blood flow of the model group significantly decreased(P0.05).Compared with the model
10、group,the wound healing rate and blood flow of rats in the Daiyu ointment group significantly increased(P0.05);Compared with the control group,CD31 positive area significantly decreased(P0.05),while significantly increased in Daiyu ointment group compared with model group;The levels of IL-1,IL-6,IL-
11、8 and TNF-in granulation tissue were significantly higher in the model group than in the control group(P0.05),and the Daiyu cream group was significantly lower than that in the model group(P0.05);wound tissue VEGF,VEGFR,EGF and PDGF in the model group were significantly higher than those in the cont
12、rol group(P0.05),and the Daiyu ointment group was significantly higher than the model group(P0.05);the levels of Nrf2 and HO-1 protein in the model group were significantly higher than those in the control group significantly higher(P0.05),and the Daiyu ointment group was significantly higher than t
13、he model group(P0.05).ConclusionDaiyu ointment can promote the healing of wounds and angiogenesis in anal fistula model rats.The mechanism may be related to the activation of Nrf2/HO-1 pathway.Key words:Nrf2;anal fistula;angiogenesis;Daiyu ointment;HO-1肛瘘是指直肠或肛管与肛周皮肤相通所形成的异常通道,中医称为“肛漏”“痔漏”“穿肠漏”等,为常见
14、肛肠疾病,患病率为 8.6/105例1。肛瘘治疗以手术为主,但术后存在疼痛剧烈、创面愈合缓慢等问题2。中 医 药 外 用 在 肛 瘘 治 疗 中 具 有 独 特 优势3。黛玉膏针对肛瘘湿热郁结而致痈溃不愈的病机而设,能够收湿敛疮、生肌止血,临床研究表明其能缩短创面愈合时间,减轻术后并发症,可能与提高 创 面 血 管 内 皮 生 长 因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平有关4。为进一步明确其作用靶点,本研究通过建立大鼠模型,深入探讨其干预的信号通路,为临床应用提供新的依据。1材料和方法1.1材料1.1.1实 验 动 物:10 周 龄 雄 性
15、 SPF 级 SD 大 鼠(20020)g 共 30 只,购于北京维通利华实验动物技术有 限 公 司,生 产 许 可 证 号【SCXK(京)2021-0011】,使用许可证号【SYXK(京)2017-0023】。适应性饲养 5 d,室温(222),采用 12 h 12 h 昼夜间断照明,自由饮食饮水。本实验已通过保定市第二 医 院 福 利 伦 理 审 查,审 查 编 号:IACUC-20210307-12。1.1.2主要试剂和仪器:黛玉膏(由保定市第二医院药剂科加工制备,组成成分:煅炉甘石 7.5 g,煅石膏 107.5 g,赤石脂 7.5 g,青黛 50 g,滑石 100 g,黄柏 50 g
16、,药物混合充分研磨成粉,过 100 目筛 2 次,加入麻油调成膏剂备用);大鼠 VEGF ELISA 检测试剂盒、大鼠血管 VEGFR ELISA 检测试剂盒(上海将来实业股份有限公司)、大鼠血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)ELISA 检测试剂盒(北京诺为生物技术有限公司)、大鼠表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA 检测试剂 盒、大 鼠 白 细 胞 介 素(interleukin,IL)-1 ELISA 检测试剂盒、大鼠 IL-6 ELISA 检测试剂盒、大鼠 IL-10 ELISA 检
17、测试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-,TNF-)ELISA 检测试剂盒(均碧云天生物技术研究所)、兔抗核因子 2 相关因子 2(nuclear factor erythroiD-2-related factor 2,Nrf2)一抗(ab137550)、兔 抗 血 红 素 氧 合 酶 1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(ab52947)、兔抗 CD31 一抗(ab182981)、兔抗-actin 一抗(ab8227),试剂购自艾博抗(上海)贸易有限公司。PeriFlux 5000 型激光多普勒血流仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);5804R
18、 高速冷冻离心机(德国 艾 本 德 股 份 公 司);奥 林 巴 斯 生 物 显 微 镜 OLYMPUS BX43(日本奥林巴斯株式会社);BioTek 81第 4 期郭伟等:基于 Nrf2/HO-1 信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响 ELx808 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);164505电泳系统、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(伯乐公司)。1.2方法1.2.1大鼠肛瘘模型的建立及分组:采用综合法构建肛瘘术后创面大鼠模型5-6,术前备皮,5%戊巴比妥钠(戊巴比妥 40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,肛门部手术区备皮消毒,采用创伤制作器在脊柱旁侧0.5 cm 处切割直径
19、约为 1.8 cm 的圆形创口,且肌层伤口深度约为 0.3 cm,止血后在创面上加粪液1 mL,固定(油纱、敷料、胶带),48 h 后去除覆盖物,若见伤口有脓性分泌物与粪臭味出现,表示造模成功。将成功建立的 20 只肛瘘术后创面大鼠,根据随机数字表,按大鼠体质量随机分为模型组(n=10)及黛玉膏组(n=10);另选择 10 只仅造成创口后不敷以粪液作为对照组。黛玉膏组大鼠使用药物涂抹伤口,对照组和模型组以 0.9%氯化钠溶液擦洗,纱布包扎伤口,每天 2 次。造模成功后当天开始治疗,各组大鼠均连续干预 14 d,后以过量麻醉药注射处死,收集创面组织用以后续实验。1.2.2创面愈合情况及局部血流监
20、测:于第 3 天药物干预结束后,采用透明格子胶片测量局部创面面积,创面愈合率=【原始创面面积(术后 3 d)-当前创面面积药物干预结束】/原始创面面积术后 3 d100%7。应用激光多普勒血流仪,所有大鼠均记录随机 3 处创面血流情况,并经 Power Lab Chart 数据采集分析系统计算 3 处创面血流取均值进行分析。1.2.3HE 染色:中性多聚甲醛固定创面组织,并用石蜡包埋,乙醇梯度脱水,二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片。将切片进行粘片、烤片,脱蜡,梯度乙醇复水后进行抗原修复。用 CD31 抗体染色(1 300)。封片后光学显微镜下观察阳性染色。1.2.4ELISA 操作步骤:取肛瘘创面
21、组织匀浆检测VEGF、VEGFR、EGF、PDGF、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-水平,严格按照说明书操作,将标准品按照说明书操作方法梯度稀释后,另取待测样品孔加样 50 L并设空白孔,后于每孔加入酶标试剂 50 L(空白孔除外),封板膜封板并置 37 恒温箱温育 60 min,每孔加满洗涤液静置 15 s 弃去,重复 5 次,先后加入显色剂 A、B 各 50 L,37 避光显色 15 min,加终止液 50 L,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度并进行浓度计算。1.2.5Western blot 法检测 Nrf2 及 HO-1 表达水平:采用 Western blot 法检测创
22、面组织 Nrf2 及 HO-1蛋白水平。使用 RIPA 高效组织裂解液提取总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度并加入 5SDS 蛋白上样缓冲液(按 1 4 的 比 例)煮 沸 后 备 用。每 孔 加 入40 g 样品或 3 L Marker 进行电泳,浓缩胶电压90 V,20 min,分离胶电压 120 V,45 min,电泳后转膜,3%BSA(体积分数 0.5%TBST)封闭 1 h。孵育一抗,分别用 Nrf2 兔单克隆抗体(1 1 500)、HO-1兔单克隆抗体(1 1 500),-actin 兔单克隆抗体(1 2 000),4 孵育过夜,后以 TBST 洗 3 次。山羊抗兔 IgG(1 5 0
23、00)室温下孵育 1 h 后,TBST 洗 3次,每次 5 min。ECL 曝光显影,Image J 图像处理软件分析结果。1.3统计学分析 采用 SPSS 27.0 统计分析软件,计量资料以均数标准差(xs)表示。组内和组间进行两两比较时,若满足正态分布且方差齐性采用 Students t 检验;若服从正态分布但方差不齐,则用 Welch s t-test;若非正态分布,则用 Mann-Whitney U test,P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组大鼠的创面愈合率比较 与对照组相比,模型组和黛玉膏组的创面愈合率显著下降(P0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠创面愈合率显著
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