黄芪甲苷治疗PM2.5致肺损伤的转录网络整合研究及实验验证.pdf
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1、2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 黄芪甲苷治疗PM2.5致肺损伤的转录网络整合研究及实验验证王依澜,沈哲睿,王振兴(成都中医药大学附属医院 成都 610072)摘要:目的挖掘黄芪甲苷介导铁死亡治疗 PM2.5 致肺损伤的调控网络,并进行实验验证。方法通过数据库、R语言和Perl软件筛选出黄芪甲苷介导铁死亡调控PM2.5致肺损伤的关键基因,构建lncRNA-miRNA-mRNA转录网络进行富
2、集分析。体内实验分为药效和机制两部分验证,药效部分中,35只雄性无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)级SD大鼠,随机分为5组。采用喉镜下气管滴注PM2.5诱导肺损伤模型。通过肺组织苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin,HE)、湿/干重比、支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor-,TNF-)和白介素1(Interleukin,IL-1)浓度评估肺损伤程度;通过透射电镜和蛋白免疫印迹法检测铁死亡水平。机制部分中,28只雄性SPF级SD大鼠,随机分为4组。RSL3在PM2.5造模前1 h腹腔注射,其余组的干预及检测
3、指标同药效部分。结果挖掘出黄芪甲苷介导铁死亡治疗PM2.5致肺损伤的16个关键lncRNA、9个关键miRNA和6个关键mRNA组成的lncRNA-miRNA-mRNA转录网络。体内实验证实,与空白组相比,PM2.5组大鼠肺损伤评分明显增高(P0.0001),伴肺水肿(P0.01);BALF中TNF-、IL-1浓度升高(P0.0001);透射电镜下可见到线粒体典型的铁死亡改变;肺组织 Nrf2、GPX4和HO-1下调(P0.0001),p-p38 MAPK和p-ERK上调(P0.01)。与PM2.5组相比,黄芪甲苷高剂量组中上述趋势显著逆转,肺损伤评分降低(P0.01),肺水肿减轻(P0.05
4、),TNF-、IL-1浓度降低(P0.01),线粒体铁死亡改善,肺组织Nrf2、GPX4、HO-1升高(P0.0001),p-p38 MAPK和p-ERK降低(P1.5 和 P0.05 为筛选条件28挖掘差异表达的lncRNA,进行 lncRNA 重注释比对及 ID 转换,得到基因名字。运用Mircode数据库(http:/www.mircode.org)预测 lnc RNA 结合的 miRNA。将预测出的 miRNA 结果运用 miRDB(http:/mirdb.org)、miRTar Base(http:/mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw)和 Target Scan(h
5、ttp:/www.targetscan.org)数据库预测miRNA映射的mRNA。1.1.3铁死亡相关基因挖掘运用FerrDb数据库,收集铁死亡的驱动基因、抑制基因及标记基因,合并后删除重复项,得到铁死亡相关的mRNA。1.1.4“黄 芪 甲 苷-疾 病-铁 死 亡 mRNA”网 络 与“lncRNA-miRNA-mRNA”转录网络的构建将疾病差异表达的lncRNA映射出的mRNA结果在数据库中进行比对,筛选出关键miRNA和lncRNA,运 用 Cytoscape3.7.0 软 件 构 建“lncRNA-miRNA-mRNA”转录网络图。同时,使用Venny2.1在线软件作图工具平台(ht
6、tps:/b.csic.es/tools/venny/),将黄芪甲苷预测靶点、PM2.5致肺损伤疾病模型预测1029 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 靶点与铁死亡预测靶点取交集,得到黄芪甲苷调控铁死亡防治PM2.5致肺损伤的mRNA韦恩图。将交集的关键mRNA输入到STRING数据库中进行检索,设置蛋白种类为“Homo sapiens”,最低相互作用阈值为0.429,构建蛋白相互作用网络
7、。1.1.5基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因百科全 书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析运用R语言Biomanager、Cluster Profiler生物信息软件包对得到的关键靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析,并将结果以条形图和气泡图形式输出。1.2体内实验验证1.2.1动物实验方案经成都中医药大学动物伦理委员会批准(2017-03),实验动物使用许可证号 SYXK(川)2015-179。本实验选用 SPF 级 SD 雄性大鼠,体质量110-150 g,4-6周龄,购自成都达硕实验动物有限公司SCX
8、K(川)2015-030。所有大鼠饲养在成都中医药大学中医脏腑病证实验室 SPF 级动物房(温度 202,相对湿度50%5%,12 h昼夜循环),予随意提供水和食物,在实验前均适应性喂养1周。1.2.2试剂黄芪甲苷(成都曼思特有限公司,批号 A0070,HPLC98%);PM2.5(美国国家标准与技术研究院,批号ID161220);增强型化学发光辣根过氧化物酶底物(美国赛默飞公司,批号34080),BCA蛋白定量试剂盒(美国赛默飞公司,批号 TF268082);检测试剂盒 IL-1(南京建成,批号H002)、检测试剂盒TNF-(南京建成,批号H052-1);抗体Nrf2(英国Abcam公司,批
9、号ab92946),抗 体 GPX4(英 国 Abcam 公 司,批 号ab125066),抗 体 HO-1(英 国 Abcam 公 司,批 号ab68477),抗体 p38 MAPK(武汉 Abclonal 公司,批号A4771)、抗体 p-p38 MAPK(武汉 Abclonal公司,批号AP0526)、抗体ERK(武汉Abclonal公司,批号A4782),抗体p-ERK(武汉Abclonal公司,批号AP0485)、抗体GAPDH(英国Abcam公司,批号ab181602),山羊抗兔二抗(武汉塞维尔生物公司,批号GB23303)。1.2.3仪器动物实验喉镜(型号YSKD,北京元森凯德)
10、,仪器倒置显微镜(型号IX51-A71PHP,德国奥林巴斯),透射电子显微镜(型号 JEM-1400-FLASH,日本尼康),小型垂直电泳系统、凝胶成像系统(型号 Universal hood,美国BIO-RAD)。2 方法 2.1动物分组及给药根据转录网络整合研究,实验分药效和机制两部分进行。在第一部分药效实验中,根据随机数字表将35只大鼠分为5组:空白组、黄芪甲苷组(100 mgkg-1)、PM2.5组、黄芪甲苷低剂量组(50 mgkg-1)、黄芪甲苷高剂量组(100 mgkg-1),每组7只。黄芪甲苷和PM2.5的给药剂量及途径根据前期研究结果确定12。黄芪甲苷组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪
11、甲苷高剂量组造模前腹腔注射相应剂量的黄芪甲苷(溶解于含0.1%二甲基亚砜的生理盐水中,给药体积 5 mLkg-1),空白组和PM2.5 组腹腔注射等量的生理盐水,每天 1 次,连续3天。腹腔注射完成后,PM2.5组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷高剂量组均在喉镜下气管内滴注PM2.5粉尘悬浮液(7.5 mgkg-1,溶于PBS中,滴注体积1 mLkg-1),每天1次,连续2天。空白组、黄芪甲苷组气管内滴注等量的PBS。在第二部分机制实验中,根据随机数字表将 28只大鼠分为 4组,PM2.5组、黄芪甲苷高剂量组(100 mgkg-1)、PM2.5+RSL3 组、黄芪甲苷高剂量(100 mgkg-1)
12、+RSL3组。黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷高剂量+RSL3组造模前腹腔注射相应剂量的黄芪甲苷,其余组腹腔注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。腹腔注射完成后,4组均予以PM2.5粉尘悬浮液气管滴注,每天1次,连续2天。PM2.5+RSL3组、黄芪甲苷高剂量+RSL3 组气管滴注前 1H 予以腹腔注射RSL3(10 mgkg-1,溶 解 于 2%二 甲 基 亚 砜+30%PEG300+2%吐温80+66%无菌无酶水,给药体积5 mLkg-1),RSL3给药剂量和途径参考现有文献制定30。所有大鼠经最后1次造模12 h后,用1%戊巴比妥麻醉并牺牲。2.2观察指标2.2.1大鼠一般情况检查观察大鼠的饮
13、食、呼吸频率、精神、毛色等一般情况,记录死亡动物数。2.2.2HE染色取大鼠部分右肺固定在4%多聚甲醛固定液,然后进行石蜡包埋,取4 m切片,进行HE染色。在显微镜下分析病理变化。1030 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与呼吸系统疾病研究2.2.3 支 气 管 肺 泡 灌 洗 液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)TNF-、IL-1测定大鼠麻醉牺牲后,止血钳结扎右侧肺门,钝
14、头针经气管缓慢注射1 mL预冷的PBS进行左侧支气管肺泡灌洗,然后回抽。每次灌洗时间3 min,回收率80%以上。连续 2次后混合,BALF 在 4下 12000 rmin-1离心10 min,收集上清液,冷冻至-80待检。根据现有检测试剂盒说明测定 BALF 中的 TNF-、IL-1浓度。2.2.4肺湿/干(wet/dry weight,W/D)比采用W/D比值评价肺水肿。取大鼠部分右肺,按湿重称重。将切除的右肺置于60恒温箱中48 h,取出再次称量为干重。2.2.5透射电镜将新鲜肺组织置于3%戊二醛预固定,1%四氧化锇再固定后,予以丙酮逐级脱水。包埋后制成50 nm超薄切片,醋酸铀与枸橼酸
15、铅染色后,用透射电镜观察肺组织切片的全图、局部和细胞器。2.2.6免疫印迹(Western blot,WB)左肺灌洗后切除,并立即在液态氮冷冻超过12 h,然后储存在-80待检。肺组织用 RIPA 裂解液匀浆后,13000 rmin-1离心10 min,取上清液进行BCA蛋白浓度测定。根据分子量的不同配置不同的电泳分离凝胶和浓缩凝胶。经过电泳,蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。用5%小牛血清白蛋白或5%脱脂牛奶封闭60 min,并与以下一图1技术路线图1031 Modernization of Traditional Chinese Me
16、dicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 抗在 4孵育过夜:Nrf2(1 1000),GPX4(1 5000),HO-1(1 20000),p38 MAPK(1 1000),p-p38 MAPK(1 1000),ERK(1 1000),p-ERK(1 1000),GAPDH(1 10000)。第2天洗膜后,用二抗在室温下孵育2 h。孵育后,使用凝胶成像系统成像,并使用 Image-Pro Plus 6.0软件进行定量分析,采用GAPDH作为内参进行归一化。2.3统计学方法采
17、用GraphPad Prism 8.1.2软件对结果进行分析,并采用单因素方差分析(ANOVA)对各组数据进行比较,方差齐时组间比较采用LSD法,方差不齐时组间比较用DuunettsT3法。数据以均值标准差(x s)表示,以P1.5和P0.05为筛选条件共获得差异表达基因541个,其中395个上调基因,146个下调基因,如图2A所 示。运 用 Perl 软 件 筛 选 出 170 个 差 异 表 达 的lncRNA(图 2B),将差异表达的 lncRNA 与 Mircode 数据库进行比对后,预测到1128个lncRNA-miRNA的调控关系。通过TargetScan、miRDB、miRTar
18、Base数据库预测miRNA-mRNA的调控关系共1935个,去除重复项后,得到1269个mRNA。3.1.3铁死亡基因筛选运用FerrDb数据库,将铁死亡的驱动基因、抑制基因及标记基因,合并后删除重复项,得到铁死亡相关的mRNA共260个。3.1.4“黄芪甲苷-PM2.5致肺损伤-铁死亡mRNA”网络与“lncRNA-miRNA-mRNA”转录网络的构建将黄芪甲苷预测的 mRNA、PM2.5致肺损伤疾病模型映射的mRNA与铁死亡相关的mRNA取交集,得到关键 mRNA成分 6个(图 3A)。将关键 mRNA导入STRING数据库,构建蛋白相互作用网络,如图 3B所示,在蛋白互作网络中,连接节
19、点最多的靶点分别是血 管 内 皮 生 长 因 子 A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、促分裂原活化蛋白激酶14(Mitogen activated protein kinase 14,MAPK14)、信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)。将关键mRNA在数据库进行比对,得到关键miRNA9个,关键lncRNA16个。运用Cytoscape3.7.0软件构建“lncRNA-miRNA-mRNA”转录网络,见图3C。在网络图中,深蓝色圆形节
20、点代表lncRNA,浅蓝色多边形节点代表miRNA,红色矩形节点代表黄芪甲苷-PM2.5致肺损伤-铁死亡的关键靶点,表明黄芪甲苷对PM2.5致肺损伤的疗效是多靶点的共同作用。其中,LINC00476在lncRNA-miRNA网络中连接节点最多;hsa-miR-17-5p、hsa-miR-20b-5p 在 miRNA-mRNA网络中连接节点最多。图2差异基因表达1032 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与呼吸系
21、统疾病研究3.1.5关键靶点富集分析运用R语言Biomanager、Cluster Profiler生物信息软件包对得到的关键靶点进行 GO 功能及 KEGG 通路富集分析。GO结果显示,黄芪甲苷-PM2.5致肺损伤-铁死亡交集靶基因富集的关键生物学过程通路中,主要集中在丝氨酸磷酸化、生长发育调控方面;在细胞组分表达过程中,涉及胞质囊腔、富含纤胶凝蛋白1-颗粒体等;在分子功能相关过程中,主要包括丝裂原活化蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、细胞因子受体结合,表明黄芪甲苷可以通过参与调控多种生物学功能而发挥抗 PM2.5致肺损伤的作用(图 4A)。在 KEGG 富集分析中,前 20 条 K
22、EGG通路形成 KEGG 功能富集的气泡图,p.adjust 代表富集的显著性,颜色越红,显著性越高。其中涉及的通路 主 要 包 括 晚 期 糖 基 化 终 末 产 物(Advanced glycosylation end products,AGE)信号通路、叉头框转录因子(Forkhead transcription factors,FoxO)信号通路、MAPK 信号通路等(图 4B)。提示黄芪甲苷介导铁死亡防治 PM2.5 致肺损伤与多通路、多生物过程相关。3.2体内实验药效验证3.2.1肺组织HE染色及W/D如图5所示,第一部分实验中肺组织HE染色结果表明,与空白组相比,PM2.5组肺组
23、织损伤严重,肺泡组织间隔增宽,肺泡腔内有大量红细胞渗出,肺间质血管扩张、充血。黄芪甲苷预处理后,肺组织损伤呈剂量依赖性减轻,肺损伤的半定量分析总结在表1中。PM2.5组的W/D显著高于空白组,而采用黄芪甲苷预处理后,W/D降低(见表2)。3.2.2支气管肺泡灌洗液TNF-、IL-1水平PM2.5引起炎症的能力是细颗粒物和肺部疾病恶化之间关联的基础。气管内灌注 PM2.5后,BALF 中TNF-、IL-1显著升高。而黄芪甲苷处理后,显著抑制了BALF中炎症因子的表达(见表3)。这些结果表明,黄芪甲苷预处理减轻了PM2.5诱导的大鼠肺组织损伤及炎症。3.2.3透射电镜如图6所示,通过透射电镜观察型
24、肺泡上皮细胞发现,与空白组相比,PM2.5组中出现铁死亡的特征性改变,包括线粒体嵴减少、线粒体电子密度增加、线粒体体积减小、双层膜密度增加、细胞核大小正常。而黄芪甲苷干预后,能明显改善电镜下线粒体的铁死亡改变,其中高剂量组改善最明显。3.2.4Western blot检测了黄芪甲苷预处理对铁死亡关键蛋白Nrf2及其下游 GPX4、HO-1的影响,同时检测了基于生物信息结合网络药理学数据挖掘的关键mRNA所富集的MAPK信号通路相关蛋白p38 MAPK、ERK、p-p38 MAPK和p-ERK。免疫印迹结果提示,与空白组相比,PM2.5组中Nrf2、GPX4、HO-1的表达显著降低,而p-p38
25、 MAPK、p-ERK水平显著升高(见表4、图7)。与PM2.5组相比,黄芪甲苷以剂量依赖的方式逆转这一现象,与电镜结果趋势类似。3.3体内实验机制验证3.3.1肺组织HE染色如图 8所示,与 PM2.5组相比,RSL3的干预加重了肺组织的损伤,可见肺泡腔内有大量红细胞渗出,组织间隔增宽,消除了黄芪甲苷的治疗作用。3.3.2透射电镜与PM2.5组相比,RSL3干预引起了明显且典型的铁死亡改变,型肺泡上皮细胞中的线粒体体积缩小,线粒体嵴减少,电子密度明显增加。与黄芪甲苷高剂量组相比,RSL3的干预逆转了黄芪甲苷改善铁死亡的作用(见图9)。图3转录网络整合1033 Modernization of
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