核酸扩增技术检测circRNA研究进展.pdf
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1、山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences,August 2023,Vol.44 No.8核酸扩增技术检测circRNA研究进展王刚1 许艳2 高雪芹21.山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院)肿瘤中心,山东 济南 250014;2.山东中医药大学中医学院,山东 济南 250355 摘要:环状RNA(circular RNA,circRNA)是与疾病发生、发展密切相关的一类非编码RNA,其为共价闭
2、合的环状结构,与线性RNA相比稳定性更好,有望成为疾病检测、诊断的新型指标。circRNA的检测,尤其是定量检测对疾病的诊断十分重要。目前,以核酸扩增为基础的检测是circRNA定量最主要的方法,因此本文总结了以核酸扩增为基础的circRNA检测方法,主要包括以PCR和等温扩增技术为基础的扩增方法,期望为circRNA检测提供理论依据。关键词:环状RNA;聚合酶链式反应;等温扩增技术doi:10.3969/j.issn.2097-0005.2023.08.013Research progress of detection of circRNA based on nucleic acid amp
3、lification.WANG Gang1,XU Yan2,GAO Xueqin21.Departmentof Oncology,The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University&Shandong Provincial Qianfoshan Hospital,Jinan 250014,China;2.College of Traditional Chinese Medicine,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Ch
4、ina;Abstract:Circular RNA(circRNA)discovered in recent years is a type of non-coding RNA and closely related to disease occurrence and development.Compared with linear RNA,circRNA has a more stable covalent closed circular structure,making it a novel biomarker for the detection and diagnosis of dise
5、ases.The detection of circRNA,especially quantitative detection,is essential for the diagnosis of diseases.Currently,the main method for the quantification of circRNA is based on nucleic acid amplification.In this paper,we summarize the amplification methods of circRNA detection based on nucleic aci
6、d amplification,mainly including polymerase chain reaction(PCR)and isothermal amplification,expecting to provide a theoretical basis for circRNA detection.Key words:circRNA;polymerase chain reaction;isothermal amplification环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类具有共价闭环结构的RNA分子,在真核生物细胞中广泛表达,且参与多种生命活动的调控 1-2。研究
7、发现,circRNA可以作为“海绵”吸附相应的小分子RNA(microRNA,miRNA),从而调节疾病的进展 3-4。最近的研究发现,circRNA 也可以直接与信 使 RNA(messenger RNA,mRNA)作用,通过募集RNA结合蛋白的来增加mRNA的稳定性,并促进其翻译 1。另有研究发现,有些circRNA也具有指导多肽翻译的潜质 5。circRNA在生物体内相对稳定的环状结构和重要生物调节作用逐渐受到研究者的重视,有望成为临床疾病诊断的新型指标。目前,检测circRNA的方法有RNA测序(RNA-Seq)6-7,RNA印记技术(northern blotting)8,微型矩阵
8、9 和以核酸扩增为基础的检测方法(PCR和等温扩增技术)10。RNA测序流程相对复杂,需要昂贵的仪器和专业的人员分析检测结果 11;微型矩阵更适合circRNA定性检测 9;RNA印记技术灵敏度较低,且操作复杂 12,而核酸扩增为基础的检测方法操作相对简单,且能定量检测circRNA,最有可能成为临床circRNA检测技术。本文主要总结、比较以核酸扩增为基础的circRNA检测方法(详见表1),以期为circRNA的检测提供理论依据。基金项目:山东省医药卫生科技发展计划项目(2019WS551)。作者简介:王刚,博士,医师,研究方向:肿瘤标志物鉴定与检测,E-mail:。通信作者:高雪芹,博士
9、,讲师,研究方向:核酸检测,E-mail:。618山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences,August 2023,Vol.44 No.81PCR1.1实时定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)研究circRNA表达变化时,qRT-PCR是最常用的方法,其重复性高、检测灵敏13,是circRNA定量检测的
10、“金标准”。使用qRT-PCR检测circRNA时,首先提取细胞或组织中的总RNA,接下来用核糖核酸酶 R(ribonuclease R,RNase R)水解掉线性的RNA,然后逆转录获取 cDNA,PCR 检测 cDNA 浓度20。检测、确认circRNA时,关键是验证引物的设计,其引物设计的原则和其他核酸序列引物设计原则一致,比如引物长度为20 nt左右,Tm为58 60,产物长度120 200 nt13。但是,与其他线性RNA 检测相比,还需要增加成环的验证,因此circRNA 引物设计时需要将引物设计在连接点两侧,其PCR产物里包括了首尾相接的连接点21。相应circRNA 验证引物设
11、计需要以下几个步骤21,查 找 circRNA 的 碱 基 序 列:在“UCSC genome browser(https:/genome.ucsc.edu/)”查找相应circRNA序列;模板准备:将circRNA序列3末端100 nt 碱基序列加到 5末端的 100 nt 的序列上;引物设计:利用Primer 3或者NCBI primer-BLAST设计引物,最终PCR产物包含120 200 nt碱基。目前,qRT-PCR是circRNA定量检测重复性最好的方法,但是在检测过程中也会存在一些缺点。首先,与线性RNA相比,circRNA在相应细胞或组织里的浓度较低,不利于其定量22。其次,q
12、RT-PCR检测需要RNase R水解线性RNA,但在此过程中可能无法水解具有二级结构的线性RNA。另外,RNase R也可水解分子量较大的circRNA,给最终结果带来较大的误差8。更重要的是,在逆转录的过程中,1个circRNA分子可能产生多个cDNA,可使最终的结果偏高23。1.2微滴数字逆转录 PCR(droplet digital PCR,ddPCR)为了克服RT-PCR中的缺点,李天文等24采用ddPCR技术检测胃癌相关的circRNA。ddPCR技术是近些年开发的第三代PCR技术,可对目标核酸分子进行定量检测。结合流体技术和乳化化学,样品被分成成千上万纳升大小的液滴,每个液滴都支
13、持单端点PCR扩增。最后,根据泊松算法,计算出原始样本中目标核酸的绝对含量 25。与常规定量PCR相比,ddPCR耗时,成本较高,但其定量不依赖标准曲线或者Ct值,定量更加准确 26。目前,ddPCR 应用在临床、食品、饲料等多方面,可以用于细菌、病毒、基因突变和甲基化等的检测27-30。其检测目标样品时包括了多个检测步骤,主要为样品准备、液滴准备、PCR扩增、液滴统计、数据分析,具体的操作流程如下31:准备PCR反应体系:此过程和常规PCR类似,将反应所需要的PCR反应液、扩增引物,待检测cDNA混匀,注意无模板样品和阴性样品的设置。微滴制备:将A过程中混匀的PCR反应液加入到微滴发生器的样
14、品孔道,与此同时油性乳浊液也注射到微滴发生器中的油孔道,随后将其放入微滴产生仪中,使PCR反应液和乳浊液混合。PCR反应:将油水混合液移到96孔板中,预热后进行PCR反应。数据统计:PCR反应结束后,将96孔板放入微滴计数仪中分析结果。1.3连接酶-PCR2020年,Zhang等10建立了连接酶-PCR技术特异检测 circRNA。此方法具体检测原理和过程如下:针对circRNA反向剪接连接点两侧的序列设计探针(探针A和B),每一条探针包括了引物特异性序 列 和 circRNA 特 异 性 识 别 序 列。检 测 相 关circRNA时,首先时是探针和待检测目标杂交,接下来splintR连接酶
15、作用于杂交产物。如果待检测目表格1以核酸扩增为基础检测技术检测circRNA的比较检测方法实时定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)微滴数字逆转录PCR(droplet digital PCR,ddPCR)连接酶-PCR逆转录滚环扩增(reverse transcriptionrolling circle amplification,RT-RCA)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)网状杂交链式反应(netlike hybri
16、dization chain reaction,HCR)双链特异性核酸酶依赖检测优点技术比较成熟、重复性高、检测灵敏13。高特异性、高灵敏度,绝度定量的同时不受PCR抑制剂的影响定量不依赖标准曲线15不需要逆转录、检测快速、简单10操作简单、成本低、特异性高11检测灵敏16不需要RNase R处理、检测方便、特异性高18检测灵敏、快速、易操作;可在真实样本中显示荧光19缺点绝对定量需要绘制标准曲线14,增加了工作强度操作繁琐、仪器价格较高、需要专业人员分析结果15低通量10尚需验证是否适合不同分子量大小的circRNA容易出现假阳性扩增17反应比较复杂需要提前RNase R处理检测样本1961
17、9山东第一医科大学(山东省医学科学院)学报 2023年8月第44卷第8期Journal of Shandong First Medical University&Shandong Academy of Medical Sciences,August 2023,Vol.44 No.8标是相关circRNA,会产生DNA模板,启动PCR反应,反之最后无法进行PCR扩增。连接酶-PCR能够定量检测circRNA,可以跨5个梯度浓度对相应circRNA定量,最低检测浓度为1 fM。这种检测方法不用进行逆转录过程,且操作简单。2等温扩增方法20世纪90年代,等温扩增技术的出现为核酸扩增检测提供了更多的选
18、择,其能在恒温下迅速、高效的扩增目的序列32。目前,等温扩增技术已经用于circRNA的检测,近些年,人们采用滚环扩增、环介导的等温扩增等扩增技术检测circRNA,实现了circRNA的高效、低成本检测。2.1滚环扩增检测circRNA滚环扩增(rolling cycle amplification,RCA)以单链环形核苷酸链为模板,以一段单链核酸(可以是待检测的miRNA或者长核酸链)为引物,对其进行延伸扩增,最终产物里面包含了大量重复的DNA序列33。目前,滚环扩增是检测circRNA使用频率最高的等温扩增技术。2019 年,Boss 等34建立了检测 circRNA 的RCA平台。在该
19、方法中以待检测circRNA直接作为RCA扩增的模板,针对其设计特异性扩增逆转录引物,具体的检测原理为:针对circRNA设计特异性逆转录引物1或者逆转录引物2,如果采用逆转录引物 1 检测,circRNA 能进行逆转录滚环扩增,最终得到不同分子量大小的cDNA,而相应的线性RNA只能产生一种分子量的cDNA。逆转录引物2针对circRNA反向剪接位点设计,只能扩增circRNA。2020年,Liu等11也采用了相似的思路检测建立了RT-RCA检测circRNA,其在检测过程中针对RCA产物设计特异性分子信标,通过荧光信号的收集判读结果。Jiao 等35设计了线性 DNA 纳米结构来检测cir
20、cRNA,其针对RCA产物设计2个发卡状的探针1和2。在检测时,RCA产物、检测探针1和2共同组成线性 DNA 纳米结构,接下来相应 circRNA 存在时,与探针1杂交促使2条探针构象都发生变化,从而促使探针1与探针2结合,最终产生荧光信号35。Dong等18以网状杂交链式反应为基础,联合RCA建立了 circRNA 快速检测的技术。首先,对目标circRNA进行逆转录滚环扩增,得到RCA产物。接下来对RCA产物特异设计了Trigger、H1,H2 3条探针进行杂交链式反应,实现检测信号的放大。这种方法,提高了检测的灵敏度,可检测到 0.1 pM 的circRNA,但是设计本身比较复杂,较难
21、控制。RT-RCA检测circRNA时可以针对反向剪接位点设计引物,不用 RNaseR 消化线性 RNA,实现circRNA 特异性扩增,避免了 RNaseR 的影响。但是,circRNA的分子量大小不一样,RT-RCA是否适合不同分子量大小的circRNA进行扩增,尚需验证。2.2 环 介 导 等 温 扩 增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测circRNALAMP是2000年由日本科学家Notomi建立的体外核酸检测技术,其针对目的序列设计2对引物,识别目的序列的 6 个区域,实现快速、高效的检测36。目前LAMP已经应用于各种病原
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