改变培养条件下藻栖棘孢木霉cf44-2中的没药烷类倍半萜衍生物的分离纯化与鉴定.pdf
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1、化学与生物工程 ,V o l N o w w w h x y s w g c c o m C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g 基金项目:山东省自然科学基金青年项目(Z R Q C )收稿日期:作者简介:于汶莉(),女,山东烟台人,硕士研究生,研究方向:海洋天然产物化学,E m a i l:w l y uy i c a c c n;通讯作者:宋银平,助理研究员,E m a i l:y p s o n g y i c a c c n.D O I:/j i s s n 于汶莉,宋银平,季乃云改变培养条件下藻栖棘孢木霉c f 中的没药烷类倍半萜衍
2、生物的分离纯化与鉴定J化学与生物工程,():,YU W L,S ON GYP,J INY I s o l a t i o n,p u r i f i c a t i o n,a n di d e n t i f i c a t i o no fb i s a b o l a n es e s q u i t e r p e n ed e r i v a t i v e sf r o mT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u mc f b yc h a n g i n gc u l t u r ec o n d i t i o n sJ C h e m i
3、s t r y&B i o e n g i n e e r i n g,():,改变培养条件下藻栖棘孢木霉c f 中的没药烷类倍半萜衍生物的分离纯化与鉴定于汶莉,宋银平,季乃云(中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 ;中国科学院大学,北京 )摘要:通过改变培养条件,并采用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、S e p h a d e xLH 凝胶柱层析、制备薄层层析、半制备高效液相色谱等分离纯化手段,从棘孢木霉c f 发酵产物中获得个没药烷类倍半萜衍生物,包含个降没药烷倍半萜.通过HNMR、C NMR分析并与文献比对,将其鉴定为(S,R,S)z i n g i b e r e n o l()、(R,
4、S),b i s a b o l a d i e n o n e()、t r i c h o d o n eA()、t r i c h o b i s a b o l i nZ()、t r i c h o b i s a b o l i nQ()、t r i c h o b i s a b o l i nN()、t r i c h o b i s a b o l i nS()和t r i c h o b i s a b o l i nM().化合物是在改变培养条件下获得的新的没药烷类倍半萜衍生物,其中部分化合物具有一定的生物活性.表明,改变培养条件是使棘孢木霉中萜类代谢产物多样化的有效途径,为
5、深入挖掘棘孢木霉次级代谢产物提供了依据.关键词:木霉;棘孢木霉;次级代谢产物;倍半萜;没药烷中图分类号:O R I s o l a t i o n,P u r i f i c a t i o n,a n dI d e n t i f i c a t i o no fB i s a b o l a n eS e s q u i t e r p e n eD e r i v a t i v e sf r o mT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u mc f b yC h a n g i n gC u l t u r eC o n d i t i o n sY
6、 U W e n l i,S O N GY i n p i n g,J IN a i y u n(Y a n t a i I n s t i t u t eo fC o a s t a lZ o n eR e s e a r c h,C h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,Y a n t a i ,C h i n a;U n i v e r s i t yo fC h i n e s eA c a d e m yo fS c i e n c e s,B e i j i n g ,C h i n a)A b s t r a c t:B yc h
7、a n g i n g t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s,a n du s i n gs i l i c ag e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y,r e v e r s ep h a s e s i l i c ag e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y,S e p h a d e xLH g e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y,p r e p a r a t i v e t h i n l a y
8、e r c h r o m a t o g r a p h y,a n ds e m i p r e p a r a t i v eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y,w eo b t a i n e de i g h tb i s a b o l a n es e s q u i t e r p e n ed e r i v a t i v e s f r o mt h e f e r m e n t a t i o np r o d u c to fT r i c h o d e r m aa
9、 s p e r e l l u mc f ,i n c l u d i n gf i v en o r b i s a b o l a n es e s q u i t e r p e n e s T h r o u g ha n a l y s e s o fHNMRa n d C NMRa n d l i t e r a t u r e c o m p a r i s o n,t h e e i g h t d e r i v a t i v e s a r e i d e n t i f i e da s(S,R,S)z i n g i b e r e n o l(),(R,S),b
10、i s a b o l a d i e n o n e(),t r i c h o d o n eA(),t r i c h o b i s a b o l i nZ(),t r i c h o b i s a b o l i nQ(),t r i c h o b i s a b o l i nN(),t r i c h o b i s a b o l i nS(),a n dt r i c h o b i s a b o l i nM()C o m p o u n d sa r en e wb i s a b o l a n es e s q u i t e r p e n ed e r i
11、 v a t i v e su n d e rt h ec h a n g e dc u l t u r ec o n d i t i o n s,s o m eo fw h i c hh a v e c e r t a i nb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s T h e s t u d ys h o w s t h a t c h a n g i n g t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s i s a ne f f e c t i v ew a yt od i v e r s i f yt h e t
12、e r p e n o i dm e t a b o l i t e s i nT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m,w h i c hp r o v i d e sar e f e r e n c ef o r f u r t h e re x c a v a t i o no f t h es e c o n d a r ym e t a b o l i t eo fT r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m于汶莉,等:改变培养条件下藻栖棘孢木霉c f 中的没药烷类倍半萜衍生物的分离纯化与鉴定/年第期 K e
13、 y w o r d s:T r i c h o d e r m a;T r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m;s e c o n d a r ym e t a b o l i t e;s e s q u i t e r p e n e;b i s a b o l a n e木霉属真菌种类及次级代谢产物具有多样性、复杂性和丰富性特点,已从木霉属真菌中分离、鉴定了许多结构新颖的次级代谢产物,包括萜类、聚酮类、甾体类、生物碱类、肽类等 ,其中萜类化合物含量较丰富.近年来,一些结构骨架独特、取代类型新颖的萜类化合物陆续在海洋木霉中被发现 ,这些新的萜类化合物具
14、有多种生物活性,如抗菌活性、细胞毒活性以及对海洋浮游生物的抑制活性等 .海洋来源的棘孢木霉(T r i c h o d e r m aa s p e r e l l u m)是已知次级代谢产物较为丰富的真菌,已鉴定出新化合物 多个,结构类型涵盖倍半萜、二萜、甾体、聚酮、生物碱和肽类 .棘孢木霉c f 是从舟山群岛褐藻门马尾藻属海藻(S a r g a s s u ms p)的内部组织中分离得到的株内生真菌,此前对其次级代谢产物研究时得到了包括甾体类衍生物(t r i c h o l u m i nA)、环橙花烷 类 倍 半 萜(c y c l o n e r e n ,t r i o l、c
15、y c l o n e r e n ,t r i o l、,e p o x y c y c l o n e r a n ,t r i o l)、没药烷类倍半萜(t r i c h a s p i n、t r i c h a s p s i d eA、t r i c h a s p s i d e B、b i s a b o l a n ,t r i o l、n o r a c e t o x y b i s a b o l e n ,t r i o l)等新化合物 ,但从该菌株中发现的没药烷类倍半萜的数量少于其它同种菌株.为深入挖掘海洋藻栖棘孢木霉c f 中倍半萜类化合物的化学多样性,作者通过
16、改变培养条件,获得一系列结构多样的没药烷类倍半萜衍生物,并对其结构进行鉴定.实验 材料、试剂与仪器G F 硅胶板、硅胶填料(目、目),青岛海洋化工厂;S e p h a d e xLH 填料,G E公司;R P 填料,YMC公司.除色谱级甲醇和色谱级乙腈外,其余均为分析纯有机试剂,上海国药集团化学试剂有限公司.B r u k e rAVAN C E 型超导核磁共振波谱仪(HNMR为 MH z,C NMR为 MH z);A g i l e n t 型高效液相色谱系统(E c l i p e s eS B C 色谱柱,mm mm,m).菌株与培养基棘孢木霉c f ,自舟山群岛近岸采集的褐藻门马尾藻
17、属海藻(S a r g a s s u ms p)的内生丝状真菌,鉴定信息参见文献,菌株序列已提交G e n b a n k数据库(序列号:MG ),现保藏于中国典型培养物保藏中心(C C T C C:M ).大米固体培养基:L培养瓶中加入大米 g、蒸馏水 m L、陈海水 m L、蛋白胨 g.方法 菌株培养选用大米固体培养基培养菌株c f ,共培养 瓶(L),在 下静态培养 d.发酵产物的分离纯化菌株c f 静态培养 d后,加入 m L乙酸乙酯,浸泡 h;抽滤,将菌丝体与液体分开;液体用乙酸乙酯反复萃取次后,有机相减压浓缩,即得发酵液粗提物;菌丝体自然风干,粉碎后用二氯甲烷甲醇(,体积比)浸泡
18、提取,共提取次,抽滤,有机相减压浓缩,即得菌丝体粗提物;合并发酵液粗提物和菌丝体粗提物,即得总粗提物.将总粗提物进行硅胶柱层析,收集各组分;再经反相硅胶柱层析、S e p h a d e xLH 凝胶柱层析、硅胶柱层析、制备薄层层析(T L C检测用 n m和 n m暗箱三用紫外灯观察,或采用硫酸茴香醛显色剂加热显色)、半制备高效液相色谱等方法分离纯化.纯化产物的结构鉴定通过HNMR、C NMR分析并比对文献数据,对纯化产物的结构进行鉴定.结果与讨论 结构鉴定从棘孢木霉c f 发酵产物中获得个没药烷类倍半萜衍生物,其结构式如图所示.化合物:无色油状.HNMR(MH z,C D C l),:(H
19、,d t,J H z、H z,H ),(H,d t,J H z、H z,H ),(H,t,J H z,H ),(H,s,H ),(H,s,H ),(H,t,J H z,H ),(H,d d,J H z、H z,H ).C NMR(MH z,C D C l),:(C ,CH),(C ,CH),(C ,C),(C ,CH),(C ,C),(C,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH).通 过 比 对,化 合 物的HNMR、C NMR数据与文献 报道化合物(S,R,S)z i n g i b
20、 e r e n o l的数据一致.此前对棘孢木霉c f 的于汶莉,等:改变培养条件下藻栖棘孢木霉c f 中的没药烷类倍半萜衍生物的分离纯化与鉴定/年第期 12345678OHHOOHOHOHOHHHHHHHHOOOOHOOOOHOOH1357911131514图个没药烷类倍半萜衍生物的结构式F i g S t r u c t u r a l f o r m u l a so f e i g h tb i s a b o l a n e s e s q u i t e r p e n ed e r i v a t i v e s次级代谢产物研究中,同样分离得到化合物.化合物:无色油状.HNMR
21、(MH z,C D C l),:(H,m,H ),(H,t m,J H z,H ),(H,d t,J H z、H z,H ),(H,m,H ),(H,s,H ),(H,s,H ),(H,m,H ),(H,d,J H z,H ).C NMR(MH z,C D C l),:(C ,C),(C ,C),(C ,C),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH).通过比对,化合物的HNMR、C NMR数据与文献 报道化合物(R,S),b i s a b o
22、l a d i e n o n e的数据一致.化合物:无色油状.HNMR(MH z,C D C l),:(H,s,H ),(H,d d,J H z、H z,H ),(H,d t,J H z、H z,H ),(H,s,H ),(H,s,H ),(H,s,H ),(H,d,J H z,H ).C NMR(MH z,C D C l),:(C ,C),(C ,C),(C ,CH),(C ,CH),(C ,C),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH),(C ,CH).通 过 比 对,化 合 物的HNM
23、R、C NMR数据与文献 报道化合物t r i c h o d o n eA的数据一致.化合 物:均 为 无 色 油 状.通 过HNMR、C NMR数据分析并结合文献数据,发现与t r i c h o b i s a b o l i nZ()、t r i c h o b i s a b o l i nQ()、t r i c h o b i s a b o l i nN()、t r i c h o b i s a b o l i nS()、t r i c h o b i s a b o l i n M()数据一致,相关波谱数据见文献 .讨论棘孢木霉是海洋木霉属真菌中的重要一员.目前,涉及次级代谢
24、产物的海洋来源棘孢木霉至少有株(d l 、Y 、A YMD 、c f 、Y 或 以及株未编号的棘孢木霉),其中有株为藻栖棘孢木霉.已报道的海洋来源棘孢木霉次级代谢产物具有高度的新颖性和多样性,包括倍半萜及其衍生物、二萜、聚酮、多肽等.其中倍半萜及其衍生物占绝大多数且种类丰富,包括 个没药烷类倍半萜、个环橙花烷类倍 半 萜、个 杜 松 烷 类 倍 半 萜 等,.S o n g等 在研究藻栖棘孢木霉A YMD 的次级代谢产物时,以大米为基质对菌株进行培养,发现了个新的没药烷类倍半萜、个新的环橙花烷类倍半萜及个已知的环橙花烷类倍半萜.藻栖棘孢木霉c f 在此前的研究中以马铃薯为基质进行发酵培养,得到
25、了包括个甾体类衍生物、个环橙花烷类倍半萜、个没药烷类倍半萜在内的新化合物 ,其中没药烷类倍半萜相较于其它同种菌株的数量较少.众所周知,培养条件不同对真菌次级代谢产物具有显著影响 .基于此,S h i等 以土豆为基质对棘孢木霉Y 进行培养,发现了个新的没药烷类衍生物.本研究通过改变培养条件,选用大米固体培养基对棘孢木霉c f 进行培养,除同样获得化合物外,新代谢产生了个新的没药烷类倍半萜衍生物,其中含个降没药烷倍半萜.由此可以推测,以大米为基质对棘孢木霉c f 进行培养,在一定程度上可以增加其次级代谢产物中没药烷类倍半萜的数量及结构多样性;不同棘孢木霉的代谢产物类型受菌株自身代谢以及培养条件的影
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