果糖二磷酸醛缩酶C在结肠癌组织和细胞中的表达及其对生物学行为的影响.pdf
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1、实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15果糖二磷酸醛缩酶C在结肠癌组织和细胞中的表达及其对生物学行为的影响程多1 褚菲菲2 张楠1 王晶晶1 陈梦阁1 岳文莉1 郜辉1 梁芳1郑州大学附属郑州中心医院1肿瘤康复科病区,2消化内科(郑州 450000)【摘要】目的观察果糖二磷酸醛缩酶C(fructosebisphosphate aldolase C,ALDOC)在结肠癌组织和细胞中的表达及其对生物学行为的影响。方法利用GEPIA数据库分析结肠癌组织ALDOC的表达水平。以患者癌旁组织或正常结肠
2、上皮细胞 FHC 为对照,RTqPCR 及免疫组化检测结肠癌组织和癌细胞SW620、SW480、HT29、HCT116中ALDOC mRNA和蛋白的表达,并分析ALDOC mRNA表达与患者临床病理因素的关系。将结肠癌细胞SW620分为对照组、NC inhibitor组和ALDOC inhibitor组;通过Lipofectamine 2000将ALDOC inhibitor或阴性对照转染各组SW620细胞;MTT法及癌细胞单克隆形成检测细胞增殖能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;RTqPCR检测细胞ALDOC mRNA的表达;Western blot检
3、测细胞ALDOC、金属基质蛋白酶2/9(MMP2/9)的表达。结果GEPIA数据库显示结肠癌组织ALDOC的表达水平高于正常组织(P 0.05);与癌旁组织或FHC相比,结肠癌组织和细胞SW620、SW480、HT29、HCT116中ALDOC mRNA和蛋白上调,且ALDOC mRNA水平与患者肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有明显的相关性(P 0.05);下调ALDOC mRNA能够下调MMP2、MMP9蛋白水平,抑制细胞生长,减少划痕愈合和侵袭细胞数(P 0.05)。结论ALDOC水平在结肠癌组织和细胞中表达上调,且与结肠癌患者的不良预后紧密相关。ALDOC通过调节MMP2/9调控结
4、肠癌细胞的侵袭和迁移能力。【关键词】果糖二磷酸醛缩酶C;结肠癌;侵袭;迁移;增殖【中图分类号】R735.3+5Expression of ALDOC in colon cancer tissues and cells and its effect on biological behavior CHENG Duo*,CHU Feifei,ZHANG Nan,WANG Jingjing,CHEN Mengge,YUE Wenli,GAO Hui,LIANG Fang.*Tumor Rehabilitation Ward,Zhengzhou Central Hospital Affiliated t
5、o Zhengzhou University,Zhengzhou 450000,ChinaCorresponding author:LIANG Fang Email:【Abstract】ObjectiveTo observe the expression of fructosebisphosphate aldolase C(ALDOC)in colon cancer tissues and cells and to explore its effect on biological behavior.Methods GEPIA database was used to analyze the e
6、xpression level of ALDOC in colon cancer tissues.The expression of ALDOC mRNA and protein in colon cancer tissues and cancer cells SW620,SW480,HT29 and HCT116 were detected by RTqPCR and immunohistochemistry,and the relationship between ALDOC mRNA expression and clinicopathological factors was analy
7、zed.Colon cancer cell SW620 was divided into control group,NC inhibitor group and ALDOC inhibitor group.ALDOC inhibitor or negative control was transfected into SW620 cells by lentivirus transfection kit.MTT assay and monoclonal formation of cancer cells were used to detect cell proliferation.Scratc
8、h test was used to detect cell migration ability,and transwell chamber test to detect the invasion ability of cells.The expression of ALDOC mRNA was detected by RTqPCR,and that of ALDOC and MMP2/9 was detected by western blot.Results GEPIA database showed that the expression level of ALDOC in colon
9、cancer tissues was higher than that in normal tissues(P 0.05).Compared with those in adjacent tissues or FHC,ALDOC mRNA and protein in colon cancer tissues and cells SW620,SW480,HT29 and HCT116 were upregulated,and ALDOC mRNA level was significantly correlated with tumor differentiation,TNM stage an
10、d lymph node metastasis(P 0.05).Downregulating ALDOC mRNA could downregulate MMP2 and MMP9 protein levels,inhibit cell growth,and reduce the number of wound healing and invasive cells(P 0.05).Conclusion ALDOC level is upregulated in colon cancer tissues and cells,and it is 基 础 研 究doi:10.3969/j.issn.
11、1006-5725.2023.15.007基金项目:河南省高等学校重点科研项目计划(编号:22B320010)通信作者:梁芳 Email:1893实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15closely related to the poor prognosis of colorectal cancer patients.ALDOC regulates the invasion and migration of colon cancer cells by regulating MMP2/9.【
12、Key words】fructose diphosphate aldolase C;colon cancer;invasion;migration;proliferation结肠癌(colon cancer,CC)是人类常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年升高,全世界每年新增 120 万例结肠癌患者,死亡 60 万例1。结肠癌发病机制复杂,致癌途径的激活以及防御机制的抑制是导致肿瘤的重要原因,其不但影响消化系统功能,且远处转移可累及肝脏、肺部等器官2。当结肠癌被早期诊断时,可以手术治愈,被诊断为晚期时,化疗药物的疗效便十分有限3。因此,发现新的治疗手段和治疗靶点至关重要。果糖二磷酸醛缩酶
13、 C(fructosebisphosphate aldolase C,ALDOC)作为一种糖酵解酶,也是ATP合成过程中必须需要的酶,其主要存在红细胞和骨骼肌当中45,既往研究显示 ALDOC 不仅能够参与糖酵解过程,还在细胞形态位置以及自身免疫疾病当中扮演重要角色6,随着研究的不断深入,多数学者证实糖代谢异常在肿瘤的发生发展过程起着至关重要作用,目前已成为肿瘤热点研究方向78。因此本研究拟讨ALDOC 在结肠癌组织和细胞中的表达和对结肠癌细胞 SW620 侵袭转移的影响,以期为结肠癌的临床靶向治疗提供理论依据。1材料与方法1.1一般资料选择2021年1月到2022年8月在郑州大学附属郑州中心
14、医院诊治的 90 例结肠癌患者,收集患者的病历资料(包括年龄、性别、肿瘤直径等)及手术切除的结肠癌组织标本及癌旁标本。采集的标本保存于液氮。纳入标准:(1)入选患者均经病理切片确诊为结肠癌;(2)原发性结肠癌,并未经放化疗干预;(3)病理资料均完整;(4)癌旁组织均为远离病灶位置 2 cm 以上的组织,且经病理证实正常的组织。排除标准:伴随有其他恶性肿瘤的患者。1.2研究材料人正常结肠上皮细胞株FHC、结肠癌细胞株SW620、SW480、HT29、HCT116(北纳生物科技有限公司);RPMI 1640 培养液、胰蛋白酶(美国Gibco公司);胎牛血清(中国四季青生物公司);NC inhibi
15、tor、ALDOC inhibitor(上海生物工程有限公司);LipofectamineTM2000转染试剂盒(美国 Invitrogen 公司);ALDOC、U6、GAPDH 引物(上海华大基因科技有限公司);BCA 试剂盒、ECL 显影剂(中国碧云天公司);ALDOC抗体(美国Abcam公司);基质金属蛋白酶 2/9(matrix metalloproteinase2/9,MMP2/9)抗体(美国CST 公司);二抗(北京博尔西科技有限公司);Thermo酶标仪(上海热电仪器有限公司);冷冻离心机(美国 Beckman 公司);BioRad蛋白电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪(美国伯乐公司)。
16、1.3方法1.3.1细胞培养与分组细胞培养:FHC、SW620、SW480、HT 29、HCT 116 细 胞 株,培 养 基 为RPOM1640培养基,含有10%的胎牛血清,然后置于恒温培养箱当中培养,培养条件为:37、5%CO2,每间隔2 d更换一次培养基,然后观察细胞融合度,当达到80%时,加入胰蛋白酶,将细胞消化分散,然后进行传代。细胞分组:将SW620细胞分为对照组(未经转染的细胞)、NC inhibitor 组(转染 NC inhibitor 的细胞)、ALDOC inhibitor组(转染ALDOC inhibitor的细胞)。根据 LipofectamineTM2000 说明书
17、,将 ALDOC模拟物及阴性对照转染各组 SW620、HCT116 细胞。转染4 h后更换培养基,24 h后通过qRTPCR及Western blot检测是否转染成功。1.3.2在线生物数据库分析使用GEPIA数据库分析 ALDOC 在正常结肠组织和结肠癌组织中的表达水平及对患者预后生存期的影响。1.3.3RTqPCR检测结肠癌组织及细胞中ALDOC mRNA 的表达采用 Trizol 试剂从细胞中提取总RNA,使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,并使用SYBR Green法进行扩增,U6作内参。反应条件:95预变性5 min,95 60 s,60 30 s,共40个循环。使用 2CT公
18、式计算 ALDOC 的相对表达水平。PCR 引物序列:ALDOCF:5 AAACCGAAGTCATAGCCACA3,ALDOCR:5 TCTCCTAAGCGATGCTCAAA3;GAPDHF:5 GAAGGTGAAGGTCGGAGT3,GAPDHR:5 GAAGATGGTGATGGGATTTC。1.3.4MTT法和细胞单克隆形成检测细胞增殖 细胞转染后,置于培养箱当中继续培养,培养条件:37,5%CO2,转染24 h之后,加入胰蛋白酶来对细胞进行消化,调整细胞数量为1 103,接着接种至 96 孔板,置于恒温培养箱当中培养,在 24、48、72、96 h 时,每个时间点取三个孔均加入 MTT溶
19、液,继续培养4 h,离心丢弃培养液上清,采用离心DMSO将细胞重悬,检测吸光度值(450 nm)。细胞转染后,继续培养24 h,加入消化酶调整1894实用医学杂志 2023年第39卷第15期 The Journal of Practical Medicine 2023 Vol.39 No.15各组细胞浓度为1 103/孔,接种到6孔板当中,置于恒温培养箱当中继续培养10 d,取出各组细胞,加入4%的多聚甲醛溶液,将细胞充分固定,加入结晶紫进一步的染色,采用磷酸缓冲液将多余的结晶紫清除,置于显微镜下观察计数,同时进行拍照。1.3.5划痕实验检测细胞迁移能力将各组细胞接种于 6 孔板,细胞培养 4
20、8 h,加入胰蛋白酶消化细胞,然后计数,同时采用培养基将细胞的密度调整为 1 103,接种到 6 孔板中继续进行培养,每组设 3 个复孔,观察所有的细胞呈现单臂生长时,采用 200 L 移液器的枪头进行划线,然后采用磷酸缓冲液将游离的细胞洗去,将无血清培养液加入进去继续培养,同时显微镜拍照记录划痕宽度,培养24 h再次拍照记录划痕宽度。细胞迁移率=(0 h 划痕宽度24 h 划痕宽度)/0 h 划痕宽度100%。1.3.6Transwell小室实验检测细胞侵袭能力取50 L 的 matrigel 基质胶,将其平铺在 Transwell 小室平板中,调整细胞浓度为 1 103,加入到 Trans
21、well上室,同时加入无血清的培养基进行培养,在Transwell下室当中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,然后将整个Transwell 小室放置到培养箱当中培养 24 h,培养条件为 37、5%CO2,取出细胞采用磷酸缓冲液将游离细胞去除,加入甲醛进行固定,加入1%结晶紫染色,显微镜下拍照,同时计数。1.3.7Western blot 检测细胞 ALDOC、MMP2、MMP9的表达各组细胞加入细胞裂解液,离心所得的上清即为蛋白样品,用BCA蛋白检测并调整蛋白浓度进行上样,蛋白定量变性后SDSPAGE电泳分离,然后进行转膜,转到 PVDF 膜上,加入TBST溶液(含有5%的脱脂
22、奶粉)进行封闭120 min,之后加入经过稀释的一抗ALDOC、MMP2、MMP9(浓度为1 2 000),置于4冰箱当中过夜,次日采用TBST洗涤3次后,加入二抗(浓度为1 10 000),室温下继续孵育 120 min,之后加入 ECL 显色液,避光孕育 30 min,以 GAPDH 作为内参,凝胶成像仪下拍照,进行定量分析。1.4统计学方法数据分析采用统计学软件SPSS 26.0,画图采用 Graphpad5.01,其中计量资料以均数标准差表示,组间比较采用独立t检验,计数资料以例(%)表示,采用2检验,P 0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1ALDOC在结肠癌组织中的表达GEPI
23、A 数据库分析显示结肠癌组织的 ALDOC 表达水平明显高于正常组织(图 1A),差异有统计学意义(P 0.05),说明 ALDOC 的表达在结肠癌中具有研究意义。同时本研究分析 90 例结肠癌患者组织中ALDOC mRNA(图1B)和蛋白(图1C)水平发现,与癌旁组织相比,结肠癌组织中ALDOC mRNA和蛋白水平明显升高(P 中位数)、低表达组(32例)(ALDOC mRNA 中位数)。结果(表1)显示,ALDOC 的表达水平与年龄、性别、肿瘤直径等无明显相关性(P 0.05),而与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有明显的相关性(P 0.05)。说明ALDOC在结肠癌组织中表达上调,且
24、扮演致癌基因的角色。2.2ALDOC在结肠癌细胞中的表达与正常结肠上皮细胞 FHC 相比,结肠癌细胞系 SW620、SW480、HT29、HCT116 中 ALDOC mRNA 表达量明显升高,差异有统计学意义(P 0.05),见图2A。将 ALDOC inhibitor 及 其 阴 性 对 照 转 染SW620 细胞后,RTqPCR、Western blot检测SW620细胞中ALDOC mRNA和蛋白表达水平发现,与NC inhibitor 组相比,ALDOC inhibitor 组ALDOC mRNA和蛋白水平下调(P 0.05),见图 2BC,提示成功 构 建 了 稳 定 下 调 AL
25、DOC 表 达 的 结 肠 癌 细胞系。2.3下调ALDOC抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力与NC inhibitor组相比,ALDOC inhibitor组单克隆形成数目减少(图 3B),24、48、72、96 h OD值降低(图3A),划痕变宽,愈合率降低(图3C),细胞侵袭数减少(图 3D),MMP2、MMP9 表达下调(图 3E)。说明下调 ALDOC 抑制结肠癌细胞SW620的增殖、迁移和侵袭。2.4ALDOC影响结肠癌细胞恶性表型的作用机制通过检测结肠癌组织和癌细胞中 ALDOC 水平,发现ALDOC mRNA和蛋白水平在结肠癌组织和细胞中表达上调,且ALDOC mRNA水平与
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