古尔班通古特沙漠苔藓结皮土壤中促生菌的分离筛选及促生特性研究.pdf
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1、基金项目:新疆维吾尔自治区“天山创新团队计划”项目()作者简介:王玉苗 女硕士研究生 研究方向为极端环境微生物活性代谢产物的分离、鉴定与应用:.通讯作者 女教授博士 研究方向为极端环境微生物活性代谢产物的分离、鉴定与应用:.收稿日期:古尔班通古特沙漠苔藓结皮土壤中促生菌的分离筛选及促生特性研究王玉苗 付建红 秦新政 王 俊 阮文伟 崔凤真 聂慧林(.新疆师范大学 生命科学学院 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室 干旱区植物逆境生物学实验室新疆 乌鲁木齐.新疆农业科学院微生物应用研究所 新疆特殊环境微生物实验室新疆 乌鲁木齐)摘 要 从古尔班通古特沙漠南缘苔藓结皮土壤中分离筛选植物促生菌并阐
2、明其促生特性对于发掘和应用功能性微生物制剂促进植被恢复和提升荒漠固沙能力等具有积极意义 采用富集方法从苔藓生物结皮下 土壤中分离可培养微生物 利用选择性培养基筛选具溶磷、产铁载体、分泌吲哚乙酸()特性的菌株 采用钼锑抗比色法、检测法、比色法分别测定菌株溶磷量、产生铁载体的浓度、分泌 的含量并对性能优良的菌株进行分类鉴定 共筛选出促生菌 株其中溶磷菌 株产铁载体菌 株分泌 菌 株 菌株 溶解无机磷能力最强溶磷量为./菌株 产铁载体能力最强产生铁载体的浓度 值(铁载体活性单位)为.菌株 分泌 活性最强分泌量为./菌株、同时具有溶磷、产铁载体和分泌 活性菌株 具有溶解有机磷、分泌 活性 菌株溶解无机
3、磷能力要强于溶解有机磷能力溶解无机磷菌株的溶磷量与培养液 值之间呈显著负相关 经鉴定菌株 属于芽胞杆菌属()菌株 属于寡养单胞菌属()菌株 属于赖氨酸芽胞杆菌属()这三株细菌的促生功能较多具有进一步开发为微生物肥料的潜能本研究为丰富荒漠区促生菌资源进一步深入研究苔藓结皮下土壤微生物植物互作的生态调控机制及荒漠植物促生菌的促生机理提供菌种资源关键词 苔藓生物结皮溶磷菌产铁载体菌吲哚乙酸促生特性中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .()./()./.()苔藓结皮是荒漠地区的土壤表层苔藓植物与土壤微生物一起形成的生物土壤结皮 大面积苔藓结皮的出现会
4、提高荒漠地表土壤的稳定性改善土壤养分状况为荒漠地区植被的恢复创造有利条件 植物促生细菌()是苔藓结皮的重要组分被定义为生活在土壤、叶根际能够帮助植物生长的细菌可通过其旺盛的生理代谢活动改变着沙土表面理化性质、影响土壤酶活性、调节水分传导促进了养分循环尤其是在干旱条件下通过促进土壤结皮的形成、土壤和植物养分的转化并帮助植物生长成为流动沙丘向固定和半固定沙丘转换的基础 土壤中存在的大量 可以通过溶磷、产铁载体、分泌吲哚乙酸()等方式提高植物抗逆性促进植物的快速生长为植物类群的定居和繁衍提供了良好的基础条件因而 也被应用于沙漠地区的植被恢复 新疆是我国受荒漠化危害最为严重的地区之一古尔班通古特沙漠是
5、面积最大的固定、半固定沙漠为典型的大陆性干旱气候该沙漠土壤肥力极为瘠薄沙丘表面植被覆盖度仅为 主要是一些耐旱植物和发育良好的生物结皮 为改善新疆荒漠化地区的生态过程加速荒漠化地区生态环境的恢复与重建科学家们从许多方面开展研究 目前对于古尔班通古特沙漠苔藓结皮的研究多集中于生物结皮土壤中微生物在沙漠中的时空分布特征以及土壤微生物数量、生理类群等方面而对苔藓结皮土壤中植物促生菌的资源与应用研究却鲜有报道 苔藓结皮中土壤微生物的促生能力对荒漠区下一阶段形成结构稳定的自然生态系统具有潜在的帮助 为研究荒漠区植物促生菌的溶磷、产铁、分泌 促生特性本研究拟从古尔班通古特沙漠南缘苔藓结皮土壤中分离、筛选植物
6、促生菌并对菌株的基本促生特性进行分析为丰富苔藓结皮生长发育中的促生菌资源促进植被恢复和提升荒漠固沙能力提供参考 微 生 物 学 杂 志 卷 材料与方法.材料.土壤样品的采集选择新疆古尔班通古特沙漠()南缘丘间低地作为采样区共 个采样点 每个点选取未受任何干扰、生长良好且长势一致的齿肋赤藓结皮用无菌小铲挖取苔藓结皮下、深度的土壤装入牛皮纸袋中放于 冰盒内带回实验室置于 冰箱随即进行菌株分离.培养基菌株的富集与分离纯化用 培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏一号培养基、淀粉铵盐琼脂培养基、培养基、马丁氏琼脂培养基和 培养基 溶磷菌筛选及活性测定采用 培养基:葡萄糖 ().()琼脂 蒸馏水 .培养基
7、:葡萄糖 ().蛋黄卵磷脂.酵母浸粉.琼脂 蒸馏水 .菌株分泌 的能力筛选与测定使用 液体培养基(含 色氨酸)菌株产铁载体能力的检测采用 固体培养基:蔗糖溶液 酸水解酪蛋白 /琼脂 蒸馏水 约 时缓慢加入磷酸盐缓冲液和 检测染液各 液体培养基:酪蛋白水解物 甘油 .蒸馏水 .菌株的生理生化特性试验用明胶培养基、葡萄糖蛋白胨培养基、柠檬酸钠培养基、可溶性淀粉琼脂培养基.主要试剂与仪器设备 二硝基酚指示剂和钼锑抗显色剂 试剂:./溶液 浓 蒸馏水 于使用前混合摇匀避光保存 细菌和真 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒(、上海生物工程股份有限公司)检测液:将.铬天青()溶于 去离子水中再加入 /溶液
8、(用/配制)即得溶液 将.十六烷基三甲基溴化铵()溶于 的去离子水中即得溶液 将 溶液沿烧杯壁缓缓加入 溶液中搅拌混匀即得 检测液甲基红试剂伏.普(.)试剂革兰碘溶液 恒温培养箱(太仓市实验设备厂)超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)检测仪(上海仪电科技仪器股份有限公司)水浴锅(上海一恒科学有限公司)电子天平(上海菁海仪器有限公司)紫外可见分光光度计(上海菁华科技 仪 器 有 限 公 司)台 式 高 速 冷 冻 离 心 机(湖南凯达科学仪器有限公司)恒温振荡器(上海博迅).方法.菌株的富集与分离纯化分别称取自苔藓皮下、深度的土样于含玻璃珠的牛肉膏蛋白胨液体培养基中、/振荡培养 取 土壤悬液至
9、新的牛肉膏蛋白胨液体培养基中同样条件下培养 土壤悬液在牛肉膏蛋白胨液体培养基中富集培养的步骤重复三次 苔藓结皮土壤中微生物的分离纯化采用 倍稀释法分别取浓度为、的稀释菌液.均匀涂布于.中前七种培养基平板上 倒置培养 挑取形态、颜色不一致的单菌落以分离培养基的名称进行初步命名纯化后的菌株于 保存.菌株溶磷量的测定将菌株分别点接种于 培养基和 培养基上 培养、选择具有透明圈的菌落记录溶磷圈直径/菌落直径(/)比值根据比值大小初步判断菌株溶磷特性 将产生溶磷圈的菌株活化并制成菌悬液分别接种至 液体培养基和 液体培养基(.)中培养 从第 天开始每隔 取上述培养液测定 值后离心取上清通过钼锑抗比色法测定
10、有效磷含量.产铁载体能力的测定定性测定参照陈伟等的方法将菌株点接于 固体培养基上 培养 如菌株菌落周围出现橘黄色晕圈表明菌株具有产铁载体能力测定单菌落橘黄色晕圈直径与菌落直径的比值并用“”表示 产生橘黄色晕圈且橘黄色晕圈直径和菌落直 期 王玉苗等:古尔班通古特沙漠苔藓结皮土壤中促生菌的分离筛选及促生特性研究 径的比值小于 记“”比值大于 且小于.的菌株记“”比值大于.且小于.的菌株记“”“”越多代表菌株具有越强的产铁载体的能力而菌株周围未产生橘黄色晕圈则标记为“”代表不产铁载体 参照雷平等的方法测定菌体产铁载体含量将定性测定筛选到的菌株接种至 液体培养基中 、/培养 然后将发酵液离心取上清液
11、与 检测液 充分混匀静置 后在 波长处测定吸光值()另取 检测液与 未接菌的 液体培养基混匀同上测定吸光值即为参比值()铁载体的浓度用铁载体活性单位()表示 ()/).分泌 能力的测定将分离纯化后的菌株接种于含有 /色氨酸的 液体培养基中、/培养 后取 培养液滴于白色陶瓷板上加入等体积的 试剂室温避光放置 后观察颜色变红表示菌株能够分泌 以 未接菌的 液体培养基与等体积 试剂的混合溶液为空白对照以 /的 标准液与等体积 试剂的混合溶液为阳性对照 将/的 标 准 液 稀 释 为、.、.、.、.、.、./采 用 比色 法 测 定值然后制作 标准曲线 将初筛获得的能分泌 的菌株培养液于 /离心取上清
12、液 加入等体积 试剂避光静置 后测定其 值参照 标准曲线计算单位体积菌液 的含量.优良植物促生菌株的鉴定对筛选出的优良植物促生菌形态观察及生理生化特性的测定参照伯杰氏细菌鉴定手册和真菌鉴定手册进行分析 得到的促生特性优良的 个细菌菌株、和 均用 液体培养基振荡培养 个真菌菌株 用 液体培养基振荡培养培养液离心收集菌体分别采用细菌和真菌基因组 提取试剂盒(、)进行菌株总 提取 采用细菌 通用引物 ()和 ()真菌 通用引物()和()进行 扩增电泳检测合格委托上海生工有限公司进行序列测定 将所测序列进行 同源性搜索序列比对后与菌落、菌体形态观察及细菌生理生化特性相结合进行菌株鉴定.数据处理运用 .
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