高内涵模型检测细胞焦亡用于抗炎药物筛选的实验教学设计.pdf
《高内涵模型检测细胞焦亡用于抗炎药物筛选的实验教学设计.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《高内涵模型检测细胞焦亡用于抗炎药物筛选的实验教学设计.pdf(4页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.04.127高内涵模型检测细胞焦亡用于抗炎药物筛选的实验教学设计阮班锋,陈刘赠,吴 克,张 敏(合肥学院 生物食品与环境学院,合肥 230601)摘 要 介绍为国家级大学生创新创业训练项目设计的采用高内涵模型检测细胞焦亡用于筛选抗炎药物实验教学实施结果。该实验利用 NLRP3 炎症小体活化导致细胞焦亡的理论,使用高内涵对焦亡细胞进行计数,以确定化合物对 NLRP3 炎症小体活化抑制情况,进而评价化合物抗炎活性强弱。实验结果表明:NLRP3 炎症小体活化时细胞会发生焦亡,PI 能够对焦亡的细胞染红色荧光,Hoechst 3334
2、2 能够对所有细胞染蓝色荧光。加入待筛选的化合物后,利用高内涵对不同荧光下的细胞进行计数,通过二者比值确定化合物的 NLRP3 炎性小体活化抑制活性,从而用于抗炎药物筛选。实验将 PI/Hoechst 33342 染色与高内涵结合使用,有效解决了经费不足和大型仪器设备缺乏等问题,实验成本较低,结果直观便捷,能够让学生深入、系统地了解细胞焦亡的实验原理和检测方法,让参加大学生创新创业项目的学生在掌握细胞生物学基本实验技能的同时进一步了解新药研发的基本流程,有效培养学生创新创业意识与科学素养。关键词 细胞焦亡;实验教学;高内涵;NLRP3 炎性小体抑制剂;抗炎中图分类号 G642.1;Q255文献
3、标识码 C文章编号 2095-1736(2023)04-0127-04Teaching design of the experiment“screening for anti-inflammatory agentsby detection of pyroptosis based on a high content screening model”RUAN Banfeng,CHEN Liuzeng,WU Ke,ZHANG Min School of Biology Food and Environment Hefei University Hefei 230601 Abstract The te
4、aching design of the experiment screening for anti-inflammatory agents by detection of pyroptosis based on a high content screening model was mainly introduced for the national college student innovation and entrepreneurship training program.Based on the theory of NLRP3 inflammasome activation leadi
5、ng to cell pyroptosis the high content screening model was used to count the pyroptosis cells to determine the anti-inflammatory activity of the tested compound.The experimental results indicated that when NLRP3 inflammasomes were activated cells underwent pyroptosis.PI could stain red fluorescence
6、on pyroptosis cells while the Ho-echst 33342 could stain blue fluorescence on all cells.High content screening was used to count the cells with different fluorescence the ratio was then used to determine the anti-inflammatory activity of the tested compound.The experiment combined the PI/Hoechst 333
7、42 staining with high content screening which could solve the problems of insufficient teaching funds poor experimental conditions and so on.The experiment was convenient with low cost the experimental results were intuitive and students could deeply systemati-cally and comprehensively understand th
8、e characteristics of the principle of pyroptosis.Thus students who participated in the related innovation and entrepreneurship project of college students could further understand the basic process of new drug research and develop-ment while mastered the basic experimental skills of cell biology eff
9、ectively cultivated students awareness of innovation and entrepre-neurship and scientific literacy.Keywords pyroptosis experimental teaching high content screening NLRP3 inflammasome inhibitor anti-inflammatory activity 如何在本科教育中体现创新发展的理念,培养具有创新精神和创新能力的大学生是当前教学改革的核721第 40 卷第 4 期2023 年 8 月生 物 学 杂 志JOU
10、RNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.4Aug.2023收稿日期:2023-05-24;最后修回日期:2022-06-13基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(22207028);安徽省自然科学基金项目(2108085MH318);合肥学院“生物与医药”校级重点学科项目(2023xk05)作者简介:阮班锋,博士,研究员,研究方向为天然产物药物化学,E-mail:ruanbf 通信作者:张敏,副教授,研究方向为细胞生物学,E-mail:zhangmo 心问题。细胞生物学是一门理论知识与实验技术并重的学科,尤其是细胞生物学实验技术,是推动生命科学、医学、药学等相关研究领域蓬勃发展的
11、关键核心技术之一1-2。细胞焦亡(Pyroptosis)是一种新发现的细胞死亡形式,是一种高度促炎性的细胞程序性死亡3。目前,激活 caspase-1 和 caspase-4、5、11 所引发的细胞焦亡,被认为是宿主抵抗感染的辅助免疫防御机制。此外,在炎性肠病、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、痛风性关节炎等人的自身炎症性疾病过程中也发现细胞焦亡的参与 4。NLRP3 炎症小体是一种多聚蛋白复合物,活化的炎症小体介导 IL-1 和 IL-18 的分泌,同时导致细胞焦亡5。研究发现 NLRP3 炎症小体参与机体的多种病理过程,与多种炎性疾病的发生发展密切相关。因此,通过细胞焦亡的检测筛选 NLRP3
12、炎症小体活化抑制剂在抗炎药物研发中具有重要意义6。荧光染料 PI(碘化丙啶)是一种可对 DNA 染色的细胞核染色试剂,它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链 DNA 后显红色荧光7。Hoechst 33342 可以直接透过细胞膜对活细胞和死细胞的 DNA 染色(蓝色荧光),由此可以通过荧光区分正常细胞与焦亡细胞8。利用高内涵计数不同条件下 PI 染色的焦亡细胞总数和 Hoechst 33342 染色的细胞总数,通过两者的比值(焦亡率)反映化合物的生物学活性9。目前 NLRP3 炎症小体抑制剂的筛选主要是利用ELISA 试剂盒检测化合物对 IL-1 分泌的抑制作用,但ELISA 试剂盒价格昂贵、操
13、作复杂,并且实验重复性较差,同时本科生创新创业项目受实验场地、实验仪器和经费等限制。因此,结合长期科研积累与教学工作经验,课题组专门为国家级大学生创新创业训练计划设计了基于高内涵筛选模型检测细胞焦亡从而筛选 NLRP3炎性小体抑制剂实验,通过对化合物库的筛选,寻找具有成药潜力的小分子化合物,使其具有创新创业潜力。本实验选择 NLRP3 抑制剂冬凌草甲素(Orido-nin)、MNS(3,4-Methylenedioxy-nitrostyrene)为研究对象10-11。利用 LPS/Nigericin 诱导细胞焦亡,加入不同浓度的冬凌草甲素与 3,4-亚甲二氧基-硝基苯乙烯,采用 PI/Hoec
14、hst 33342 染色焦亡细胞与正常细胞,使用高内涵进行拍照并计数。1 材料与方法1.1 材料与试剂J774A.1 细胞系购自中科院细胞库,DMEM 高糖培养基与胎牛血清购自 Hyclone 公司,青霉素-链霉素购自碧云天生物公司,PI 与 Hoechst 33342 试剂购自索莱宝公司。1.2 方法1.2.1 细胞复苏与冻存从中国科学院上海细胞库购入生长状态良好J774A.1 小鼠腹腔巨噬细胞,J774A.1 细胞用 10%进口血清配制含 1%青霉素与链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基培养。细胞培养箱 37、5%CO2。在细胞处理方面,一般 23 d 换一次液或是传一次代。显微镜下观察,当
15、细胞生长的密度达到 70%80%且生长状态良好时,可以冻存。用移液器把细胞吹落,集中到15 mL 离心管,1 500 r/min 离心 3 min,倒上清液,加冻存液重悬,转移至冻存管,封口膜封口,标记日期,短期储存 放 入-80 冰 箱,长 期 储 存 转 移 到 液 氮 罐。J774A.1 细胞进行处理时不能用胰酶消化,否则会引起细胞变异和分化。1.2.2高内涵模型的建立与 NLRP3 炎症小体体外造模 实验原理:NLRP3 炎症小体激活会引发细胞焦亡,焦亡的细胞其细胞膜会被打孔产生孔洞。碘化丙啶(PI)对细胞核 DNA 进行染色,释放可被检测的红色荧光。活细胞的细胞膜有防御和屏障作用,P
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 内涵 模型 检测 细胞 用于 抗炎药 筛选 实验教学 设计
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。