肝豆灵片通过调节TLR4_NF-κB_NLRP3信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制.pdf
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1、山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【药理与毒理】收稿日期:基金项目:安徽高 校研 究生科 学研究 项目()安 徽省自 然科学 基金()安徽 高校 自 然 科 学 研 究 项 目()安徽中医药大学第一附属医院临床科学研究项目()国家自然科学基金()安徽中医药大学科技创新基金()作者简介:闻雨雅()女硕士研究生研究方向为中医药防治神经变性疾病:.通信作者董婷()女博士主任医师博士生导师研究方向为中医药防治神经变性疾病:.肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制闻雨雅董婷江张胜陈洁田丽伟赵晨玲唐露露(.安徽中医药大学 研究生院 安徽 合肥 .安徽中医药大学第一附属医
2、院安徽 合肥)摘要:基于/信号通路探讨肝豆灵片对 小鼠肝豆状核变性神经炎症的影响以及对 诱导的小胶质细胞炎性反应的作用机制 将 小鼠分为对照组模型组肝豆灵片低、中、高剂量组青霉胺组 细胞分为对照组、模型组、肝豆灵片组、组、肝豆灵片 组采用 染色检测各组小鼠海马组织病理学改变蛋白质免疫印迹检测各组小鼠海马组织及 细胞中、蛋白的表达酶联免疫吸附测定法检测各组小鼠海马组织及 细胞中 、的含量实时荧光定量聚合链式反应检测各组 细胞中、的表达 结果表明:与对照组相比模型组海马组织出现明显炎性损伤、蛋白表达均明显增高、的含量明显升高(.)与模型组相比肝豆灵片组和青霉胺组海马组织的病理损伤均得到改善且肝豆灵
3、片高剂量组效果更明显肝豆灵片组和 组能抑制 细胞活化、蛋白与 表达较模型组均明显减少、的含量明显降低(.)肝豆灵片能减轻 小鼠海马组织炎性损伤抑制 诱导的 细胞过度活化其机制可能与下调/信号通路有关关键词:肝豆灵片肝豆状核变性/神经炎症作用机制中图分类号:文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():/(.)第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制 /.(.).(.)././肝豆状核变性()是一种以铜代谢异常为特点的常染色体隐性遗传病神经炎性损伤是引起 患者神经症状的主要因素 样受体热蛋白结构域相关蛋白 ()炎性小体在多个神经退行性病中发挥重要作用前
4、期研究证明 在 小鼠中处于高表达水平 炎症小体的激活可导致小胶质细胞产生白介素()诱导神经炎性损伤加重疾病进程 研究表明高铜能触发 依赖性小胶质细胞活化引起炎症级联反应导致神经损伤 样受体()在小胶质细胞中广泛表达其中 是激活 信号通路以响应内源性分子所必需的 信号激活后诱发 炎症小体活化募集促炎细胞因子促进炎症反应因此调控/信号通路是保证神经系统稳定的重要手段中医认为痰与瘀贯穿 始终“痰瘀伏邪”是该病一大重要学说 安徽中医药大学第一附属医院脑病中心根据 患者痰瘀互结的病证特点创制的肝豆灵片由丹参、姜黄、莪术、鸡血藤、黄连、生大黄六味中药组成具有化浊、解毒、祛瘀之效 现代药理研究显示丹参、莪术
5、、姜黄的提取物隐丹参酮、莪术醇、姜黄素对小胶质细胞炎性反应和表型转换具有干预作用 临床用于治疗 的青霉胺等金属螯合剂因出现了较多副作用而应用受限如今中医药治疗 已得到广泛认识肝豆灵片用于治疗 能通过多个途径延缓患者神经症状的发展进程临床应用近 年疗效确切且无金属螯合剂的毒副作用课题组前期已确证肝豆灵片可抑制小胶质细胞活化抑制 炎症小体表达 为肝豆灵片治疗 神经炎症损伤的关键靶点但其具体的分子机制仍不清楚 因此本研究以 小鼠为体内实验模型以 诱导的 细胞为体外实验模型/通路调控 炎症小体活化为主线探讨肝豆灵片对 神经炎性损伤的保护机制为肝豆灵片治疗 神经炎症提供理论依据山 东 科 学 年 材料与
6、仪器.实验动物选取 月龄左右无特定病原体()级的 只 雄鼠()(品系号/)和 只野生同背景型 雄鼠体重 在安徽中医药大学教育部重点实验室动物中心饲养 所有小鼠置于通风良好相对湿度 温度为 的清洁动物房内自由饮食取水并及时更换饲料 所有动物方案均经安徽中医药大学动物伦理委员会批准(批准文号).细胞株 细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司).药物与试剂肝豆灵片(生产批号 准字规格./片安徽中医药大学第一附属医院)青霉胺片(生产批号规格./片上海上药信谊药厂有限公司)胎牛血清(上海煊翎生物科技有限公司批号规格 )总 小量抽提试剂盒(广州美基生物科技有限公司批号)逆转录试剂盒(新贝(上海)生物科技有限公司
7、批号)增强型 试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司批号)酶联免疫吸附测定()试剂盒(南京建成生物工程研究所批号、)兔抗(上海碧云天生物技术有限公司规格)兔抗(公司批号 规格 )(公司批号 规格)兔抗、(武汉三鹰生物技术有限公司、规格 ).主要仪器 型倒置相差显微镜(日本 公司)型高速冷冻离心机(德国 公司)型全波段酶标仪(美国 公司)型免疫印迹系统(瑞士 公司)型实时荧光定量 仪(瑞士 公司)实验内容.体内实验.动物分组及给药 只 小鼠作为对照组 只 小鼠随机平分为 组:模型组肝豆灵片低、中、高剂量和青霉胺组给药组剂量按照给药组按体重 成人日用量的.倍进行等效剂量换算肝豆灵片低、中、高剂量组分别
8、为.、.、./灌胃青霉胺组剂量为./灌胃对照组及模型组给予等体积生理盐水等量灌胃连续 周 灌胃结束后禁食 的戊巴比妥钠(/)腹腔注射麻醉取各组小鼠海马组织分别进行液氮冷冻 保存中性福尔马林固定处理.观察肝豆灵片对 小鼠海马组织炎性损伤的影响()采用 染色观察 小鼠海马组织病理学改变取各组小鼠海马组织固定于 中性甲醛溶液中经脱水、包埋、切片、常规 染色后置于光学显微镜下观察评价海马组织病理学状态()检测各组小鼠海马组织炎症因子 、的表达取出冻存的海马组织称重后加入 倍质量的生理盐水分别在冰上研磨成匀浆后 /下 离心取上清液其余按照 试剂盒说明书步骤进行.观察肝豆灵片基于/信号通路对 小鼠神经炎症
9、的影响采用蛋白质免疫印迹()检测信号通路相关蛋白、的表达情况:分别第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制取各组小鼠海马组织在冰上进行研磨抽提组织蛋白通过 电泳以及电转移装置将蛋白质转移至 膜上 用 的 浸泡 膜室温摇床封闭 加入一抗 水平摇床孵育过夜加入二抗室温孵育 洗去多余的二抗以 为内参用 软件分析、计算目标条带的灰度值.体外实验.细胞培养复苏 细胞复苏后加入含 双抗、胎牛血清的 培养基接种于培养瓶中置于培养箱中培养(、)待细胞生长达亚融合状态用.胰蛋白酶消化传代每周传代 次取对数期的细胞进行实验.肝豆灵片含药血清的制备与保存将 只 大鼠随机分为对照组和肝
10、豆灵片组每组 只 肝豆灵片组中药含药血清组按 正常人剂量等量换算采用人的.倍剂量./()的肝豆灵片进行灌胃对照组灌等量生理盐水每天 次连续灌胃 末次灌胃后禁食 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉在无菌条件下进行腹主动脉取血离心取上清液于 水浴 用.滤器过滤除菌将滤液置于 保存备用.比色法观察细胞活性取对数生长期细胞以.个/密度接种于 孔培养板中每孔 、孵箱中培养细胞在含体积分数 胎牛血清的 培养液中培养过夜换液后继续培养 每孔分别加入/铜离子刺激 细胞在加铜离子的孔内分别加入 不同浓度的肝豆灵片含药血清(、)同时设对照组、铜离子负荷组每组设 个复孔孵育、后每孔加入 继续孵育 置酶标仪 处测吸光度 观察不同
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