共存网络分析揭示抑郁症患者肠道微生物改变.pdf
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1、神经损伤与功能重建2023年8月第18卷第8期论著共存网络分析揭示抑郁症患者肠道微生物改变陈棉棉,王培琳,谢新晖,聂昭雯,刘忠纯作者单位武汉大学人民医院精神卫生中心武汉 430060基金项目国家自然科学基金项目(No.U21A20364);国家重点研发计划(No.2018YFC1314600)收稿日期2022-12-11通讯作者刘忠纯摘要目的:建立肠道微生物共存网络,探究抑郁症(MDD)患者肠道微生物与健康对照(HC)的不同。方法:招募MDD患者和HC组受试者,各35例,收集临床症状进行评估,并采集粪便样本进行宏基因组测序,计算微生物物种之间的相关性,构建肠道微生物共存网络,分析组间网络拓扑属
2、性差异以及关键节点的改变。结果:对2组使用同种方法构建的肠道微生物共存网络的分析提示,MDD组肠道群落微生态发生变化,网络中平均度和连接性下降,种间相互作用减少,微生态关键成员改变。HC网络的模块中心节点是Rumi-nococcus flavefaciens,连接节点是Clostridium CAG 389和Lachnospiraceae bacterium A2;被识别为MDD网络模块中心节点的是uncultured Blautia sp,Bacteroides mediterraneensis和Parabacteroides distasonis。Rumi-nococcus flavefa
3、ciens和Clostridium CAG 389丰度与临床抑郁和焦虑量表得分之间存在显著相关。结论:MDD人群的肠道微生物共存网络和健康人群不同。共存网络分析有必要在肠道微生物相关研究中进一步推广和发展,以期获得更多纯丰度以外的发现。关键词抑郁症;肠道微生物;共存网络中图分类号 R741;R741.02;R749 文献标识码ADOI10.16780/ki.sjssgncj.20220984本文引用格式:陈棉棉,王培琳,谢新晖,聂昭雯,刘忠纯.共存网络分析揭示抑郁症患者肠道微生物改变J.神经损伤与功能重建,2023,18(8):465-469.Co-occurrence Network Ana
4、lysis Reveals the Changed Gut Microbiome in Patients with DepressionCHEN Mianmian,WANG Peilin,XIE Xinhui,NIE Shaowen,LIU Zhongchun.Mental Health Center,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,ChinaAbstract Objective:The co-occurrence network was established to explore the differences betwee
5、n the gut mi-crobiome of patients with major depressive disorder(MDD)and healthy controls(HCs).Methods:Thirty-fiveMDD patients and 35 HCs were recruited,and their stool samples were collected for sequencing.Correlations be-tween microbial species were calculated to construct the co-occurrence networ
6、k of gut microbiome.Differencesin network topology attributes and key nodes between groups were analyzed.Results:The analysis of gut micro-biome co-occurrence networks showed that the microecology of the gut community was changed in MDD group.The decreased average degree and connectance of the netwo
7、rk indicated the decreased interspecific interaction.Key members of the microecology were also found changed.The module hub for HC wasRuminococcus flavefa-ciens,and the connectors wereClostridium CAG 389andLachnospiraceae bacterium A2.Theuncultured Blautiasp,Bacteroides mediterranensisandParabolides
8、 distasoniswere identified as the module hubs for MDD.Besides,the abundance ofRuminococcus flavefaciensandClostridium CAG 389both showed a significant correlation be-tween clinical depression and anxiety scale scores.Conclusion:The co-occurrence network of gut microbiomein patients with MDD is diffe
9、rent from healthy controls.To obtain more findings beyond pure abundance,co-oc-currence network analysis needs to be further promoted and developed in researches related to gut microbiome.Keywordsdepression;gut microbiome;co-occurrence network0 背景抑郁症(major depressive disorder,MDD)发病率持续增高,影响患者的身心健康1。
10、MDD相关的遗传、神经内分泌和免疫相关机制受到广泛关注2。随着测序技术的发展,肠道微生物群与MDD的关系逐渐成为研究热点3,4。在抑郁症患者中检测到了肠道微生物群的改变5,将MDD患者的肠道微生物移植到啮齿类动物体内,可以诱发抑郁样行为6,7,口服益生菌后又观察到此类抑郁样行动的减少8。因此,肠道微生物群被认为与MDD的致病机制相关。然而,目前对肠道微生物群落的分析主要集中在疾病中微生物物种丰度或功能的改变,较少关注对物种间关系的探索,可能导致对微生物群落部分特征的忽略。在群落中,其组成物种不是独立的,而是相互作用的。在宏观生态研究,例如对海洋、土壤等环境微生物群落的研究中,已经广泛开展了微生
11、物共存网络(co-occurrence network)的分析,以获取微生物相互作用、结构变化的信息9,10。而在肠道微生物领域,共存网络465Neural InjuryAnd Functional Reconstruction,August 2023,Vol.18,No.8分析仍然有待发展。因此,本研究招募MDD患者,采集粪便样本进行宏基因组测序,将数据应用于微生物共存网络的构建与后续的分析。构建肠道微生物共存网络,探索与健康对照相比,MDD人群肠道微生物共存网络的改变,并比较2组网络的拓扑属性以及关键节点的变化,以补充一个新的、纯丰度或功能数据以外的视角,探索MDD中微生物物种之间相互作用
12、关系的改变,探明MDD患者失调的肠道微生态。1 资料与方法1.1 一般资料从2020年至2021年就诊于武汉大学人民医院精神卫生中心的患者中,招募首发或复发MDD患者,符合 精神障碍诊断与统计手册(第五版)(Diagnosticand Statistical Manual of Mental Disorders-fifth edition,DSM-5)中重性抑郁发作(当前2周)的诊断标准。同时招募一般人口学数据相匹配的健康人纳入对照组(healthy control,HC)。排除患有或共病符合 DSM-5标准的其他精神障碍以及脑器质疾病所致精神障碍,患有严重的躯体疾病、代谢相关疾病或者免疫相关
13、疾病,既往颅脑外伤史,1周内有益生菌、益生元、抗生素使用史的受试者。本研究通过武汉大学人民医院学术伦理道德委员会审核。所有被试均自愿参与本项研究并签署知情同意书。1.2 方法1.2.1患者信息收集为全面反映样本特征,采集一般人口学信息,并使用汉密尔顿抑郁量表(Hamiltondepression scale-17,HAMD-17)和 患 者 健 康 问 卷(Patient Health Questionnaire-9,PHQ-9)进行抑郁严重程度的他评和自评;使用汉密尔顿焦虑量表(Hamiltonanxiety scale,HAMA)和 广 泛 性 焦 虑 障 碍 量 表(Generalize
14、d Anxiexy Disorde-7,GAD-7)进行焦虑严重程度的他评和自评;患者健康问卷躯体症状群量表(Patient Health Questionnaire-15,PHQ-15)进行躯体症状严重程度的自评。粪便样本使用粪便DNA样本保存管(江苏康为世纪)采集,利用布里斯托大便评分(Bristol Stool Form Scale,BSS)对患者提供的粪便样本进行质量控制11。1.2.2宏基因组分析使用 NEBNextUltra DNALibrary Prep Kit for Illumina 试剂盒(NEB,USA)构建测序文库,Illumina Hiseq2500 测序仪(Illu
15、mina,SanDiego,CA,USA)用于测序,每个样本输出6 GB原始数据。Readfq 软件(version 8,https:/ 1.0.4-beta)组装分析,通过Bowtie2(version 2.2.4,http:/ Data分别对比至其Scaftigs上。使用MetaGeneMark 软 件(version 2.10,http:/topaz.gatech.edu/GeneMark)进行ORF预测,CD-HIT12软件(version4.5.8,http:/www.bioinformatics.org/cd-hit/)去冗余。通过Bowtie2软件将各样品Clean Data比对
16、至初始genecatalogue,计算得到各基因在各样品中的丰度信息。使 用 DIAMOND13软 件(version 0.9.9.110,https:/ Unigenes 与 NCBI的NR数据库进行比对获得各个样品在各个分类层级上的丰度信息。1.2.3微生物共存网络分析使用R语言ggclusternet包14,基于Spearman等级相关性矩阵构建种水平肠道微生物共存网络。由于低丰度物种数据可能导致计算中的假阳性,选取丰度前5%的物种数据用于后续计算分析之中。并对微生物共存网络进行可视化,其中物种用节点表示,物种之间的相关性用连接节点的边表示。R语言ggclusternet包同时用于计算网
17、络拓扑学参数,包括连接性、平均度、平均路径长度、直径、聚集系数等,并计算节点包括Zi(模块内连通度的Z-score)和Pi(模块间连通度的参与系数)值等相关属性。使用 R 语言psych包(version 2.2.5)对关键节点的相对丰度与一般人口学数据及临床量表评估结果进行Spearman相关分析,使用pheatmap包(version 1.0.12)进行可视化呈现。1.3 统计学处理使用SPSS 25.0进行统计分析。本研究中年龄、BMI值等连续变量用(xs)表示,组间比较使用独立样本均数t检验;分类数据以频数和百分比(%)表示,组间比较使用2检验;P0.05为差异有统计学意义。2 结果2
18、.1 一般人口学本研究共纳入MDD组35例,HC组35例。2组的年龄、性别、体质量指数(body mass index,BMI)、粪便性状等差异无统计学意义;在抑郁和焦虑症状的严重程度上,MDD组的自评及他评评分均显著高于HC组(P0.001),且具有更多的躯体不适症状(P0.001),见表1、表2。2.2 共存网络为了描述肠道微生物群落中物种之间潜在关系,466神经损伤与功能重建2023年8月第18卷第8期基于Spearman相关系数构建了2组微生物共存网络,见图1。分布在2个共存网络中的物种主要来自4个门(Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Pr
19、oteobact-eria)。与负相关相比,2个网络的强正相关的数量要高得多,但HC组的微生物群落网络更为复杂。为了量化差异,计算了2个微生物网络的拓扑特征,见表3。结果显示,与使用相同方法构造的HC网络相比,MDD网络显示出较少的节点数和连接数。此外,MDD中的平均度和图密度均较低,反映了MDD中物种之间的相互作用较少,网络较稀疏。2组共存网络拓扑结构复杂性不同,直径和平均聚集系数等参数均具有一定的差异。2.3 随机网络建立相同节点数以及相同连接数的Erds-Ryni随机网络,发现HC组和MDD组网络的平均聚集系数极高,但平均路径长度较小,接近随机网络,表明2组肠道网络具有小世界特性,其聚集
20、相较随机网络更为显著,见表4。从单个节点度分布图上可以看出,2组微生物的度分布遵循幂律分布规律,大部分的节点具有较低的度,只有少数核心节点具有较高的度,表明2组网络都是无标度网络,见图2。2.4 Zi-Pi为了研究MDD网络中改变的拓扑结构是否由特定的生物驱动,本研究进一步测量了网络中每个物种的相对影响。依据节点的拓扑特征寻找网络核心节点是网络分析的热点。目前,基于Zi-Pi网络核心节点判别方法得到了广泛的应用15。模块是网络中高度连接的区域,是系统发育、进化或功能上独立的单元,模块中心节点(Module hubs,模块内部具有高连通度节点,Zi 2.5且Pi 0.62)作为特定模块内复杂交互
21、网络的关键物种,对维持这一协同单元的正常功能有重要作用,连接节点(Connectors,模块之间高连通度节点,Zi 0.62)被认为可以维持网络的一致性16。我们发现在HC网络中,Ruminococcus flavefaciens是模块中心节点,Clostridium CAG 389和Lachnospiraceae bacterium.A2是连接节点;MDD 网络中uncultured Blautia sp,Bacteroides mediterraneensis和Parabacteroides distaso-nis是MDD网络的模块中心节点,见图3。表1 2组一般资料比较(xs)或例(%)
22、项目年龄/岁BMI/(kg/m2)女性药物使用无抗抑郁药其他粪便性状坚硬正常松散HC组(35例)22.13.020.52.232(91.4)35(100.0)0(0.0)0(0.0)2(5.7)29(82.9)4(11.4)MDD组(35例)21.52.6820.02.330(85.7)22(62.9)10(28.6)3(8.6)5(14.3)26(74.3)4(11.4)t/2值0.7920.9210.30216.0001.449P值0.4310.3600.7160.0010.484组别HC组MDD组t值P值例数3535HAMD-171.802.1020.65.0320.410.001HAM
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