环状RNA102272通过miR-1258调控肝癌细胞增殖.pdf
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1、摇 基金项目:锦州市指导科技计划项目,项目编号:JZ2023B047;锦州医科大学附属第一医院自然科学基金项目,项目编号:KYTD-2022012。摇 作者简介:蒋磊(1984),男,辽宁海城人,主治医师,硕士学位,主要研究方向为肝癌的诊断及治疗。摇 通讯作者:吴刚(1970),男,辽宁锦州人,主任医师,硕士学位,主要研究方向为肝癌诊断。环状 RNA_102272 通过 miR-1258 调控肝癌细胞增殖蒋磊,李玉强,李男,赵明洲,李岩,杨微微,吴刚(锦州医科大学附属第一医院,辽宁 锦州 121000)摇 摇 摘要:目的摇 明确circRNA_102272在肝癌中的表达及作用机制。方法摇 通过
2、分析 GEO 数据库数据以及收集锦州医科大学附属第一医院肝癌患者组织标本,通过 qPCR 方法检测患者组织中circRNA_102272的表达情况,通过 CCK-8 分析其对肝癌细胞增殖的影响,分析circRNA_102272的表达与临床病例参数之间的关系,通过在线数据库分析其作用机制,通过体外荧光素酶报告基因实验以及 CCK-8 明确其发挥作用的机制。结果摇 肝癌患者组织中circRNA_102272表达较癌旁正常组织中的表达升高显著。同时,circRNA_102272的表达与分化程度、转移、TNM 分期相关(P0郾 05)。miR-1258 能够逆转circRNA_102272对肝癌细胞增
3、殖的调控作用。结论摇 circRNA_102272通过 miR-1258 调控肝癌细胞增殖。关键词:肝癌;环状 RNA_102272;miR-1258;增殖中图分类号:R735郾 7摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 文章编号:2096-305X(2023)04-0027-06CircRNA_102272 Regulates the Proliferation of Hepatoma Cells Through MiR-1258Jiang Lei,Li Yuqiang,Li Nan,Zhao Mingzhou,Li Yan,Yang Weiwei,Wu Gang(The First Affi
4、liated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000 China)Abstract:Objective摇 To clarify the expression and mechanism of circRNA_102272 in liver cancer.Methods摇 The expressionof circRNA_102272 in the tissues of patients with liver cancer in the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical U
5、niversity was detectedby qPCR through the analysis of GEO database data and the collection of tissue samples.The effect of circRNA_102272 on the prolifer鄄ation of hepatocellular carcinoma cells was analyzed by CCK-8,and the relationship between the expression of circRNA_102272 andclinical case param
6、eters was analyzed.The mechanism of its action was analyzed by online database,and the mechanism of its actionwas clarified by in vitro luciferase reporter gene assay and CCK-8.Results摇The expression of circRNA_102272 in liver cancer pa鄄tients was significantly higher than that in adjacent normal ti
7、ssues.The expression of circRNA_102272 was correlated with differentia鄄tion,metastasis and TNM staging(P0郾 05).MiR-1258 could reverse the regulatory effect of circRNA_102272 on the proliferation ofhepatoma cells.Conclusion摇 CircRNA_102272 regulates the proliferation of liver cancer cells through miR
8、-1258.Key words:hepatocellular carcinoma;circRNA_102272;miR-1258;proliferation摇 摇 肝癌是世界上常见的消化系统肿瘤之一,我国肝癌的发生率与死亡率常年居高不下1。肝癌发病隐匿,早期症状不明显,多数患者就诊时就已丧失手术机会,仅能接受保守治疗,因此找寻肝癌进展的机制,开发新的作用靶点,是我们亟待解决的问题。随着人类基因组计划的完成,人们发现在生命中发挥重要作用的物质不仅仅是具有功能的蛋白质,同时不能编码蛋白的 RNA(non-coding RNA,ncRNA)同样在我们的生命过程中发挥着重要的调控作用2-3。过去的几年
9、来,以 miRNA 为代表的ncRNA 在疾病的进展中发挥着重要的调控作用4。随着人们对 ncRNA 认识的深入,环状 RNA(circu鄄lar RNA,circRNA)在疾病的调控中发挥着不可或缺的作用5。研究发现 circRNAs 是共价闭合的连续环,不具备 5忆和 3忆端结构,这一结构特点使得circRNAs 更稳定,不易被核糖核酸酶降解,使 cir鄄cRNAs 在疾病的诊治和预防中具有良好的应用价值6-7。circRNAs 不仅能够在外周血中稳定存在,同时还能通过多种方式调控肿瘤的发生发展。在过去的几年中,人们对 circRNAs 发挥作用的机制有了长足的认识,其发挥作用的机制包括
10、miRNA 海72锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2023 Aug.44(4)绵效应、调控基因转录、调控蛋白结合和参与蛋白编码等功能8。其中 circRNAs 与 miRNAs 海绵效应在肿瘤中发挥作用受到越来越多的关注。研究证实 circRNAs 能够发挥竞争内源性 RNA 的作用9。例如,hsa_circ_0008234 通过 miR-338-3p 促进肠癌恶性进展10,Has_circ_0000128 通过 miR-623促进胃腺癌细胞增殖与迁移11。有研究报道,cir鄄cRNAs 可以与具有生物学功能的蛋白质结合,进而影响细胞的生物学活性12-1
11、3。这些结果提示 circR鄄NAs 发挥海绵效应在肿瘤发生发展过程中具有重要地位。circRNA_102272 是近期发现的环状 RNA,GUAN 等研究证实circRNA_102272在肝癌耐药中具有重要调控作用14。但是其在肝癌中的进一步作用及机制仍未完全阐释清楚。miRNA 是一类内生的长度大约在 20 25 个核苷酸的微小 RNA,近年的研究证实,人体内大约30%的基因受到 miRNAs 调控15。多项研究明确了 miRNAs 在疾病进展中的重要调控作用16。miRNAs 的重要作用使其有望成为疾病,尤其是肿瘤诊断的生物标记。miR-1258 是具有重要功能的miRNA。既往文献证实
12、,miR-1258 在胃癌中低表达,上调 miR-1258 表达后能够抑制胃癌细胞侵袭与转移17。在骨肉瘤中,miR-1258 在肿瘤组织以及肿瘤细胞中的表达降低并与预后密切相关18。在肝癌中,miR-1258 同样具有重要调控作用。HUANG 等的研究证实,miR-1258 在肝癌侵袭与转移过程中具有重要调控作用19。但是 miR-1258在肝癌中的作用仍需要更多的实验数据揭示。在本研究中,我们通过分析 GEO 数据库中的肝癌数据,找寻差异显著的 circRNA,通过在组织中验证其表达并通过细胞实验进一步验证其作用及机制,希望能为肝癌的治疗提供一个新的治疗靶点。1摇 材料与方法1郾 1摇 组
13、织样本选取锦州医科大学附属第一医院临床生物样本中心 2018 年 1 月至 2020 年 10 月期间 33 例经手术切除并经过病理诊断确诊为肝细胞癌的组织样本,所有病例均有详细且完整的临床病例资料(包括患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化情况、转移情况以及 TNM 分期),所有患者术前均排除其他恶性肿瘤,未进行辅助放化疗病史的样本。所有纳入项目的患者均已签署知情同意书,同时本项目通过锦州医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。1郾 2摇 GEO 数据库筛选差异基因数据集来源:GSE97332 转录组学数据集来自于美国国立生物技术信息中心基因表达数据库(https:/www郾 ncbi郾 nlm郾
14、nih郾 gov/geo)。在 GEO 数据库中下载肝癌相关转录组学数据集,按照组织来源将数据分为 2 组:正常组织组、肝癌组。使用GEO2R 分析 2 组数据中差异表达的基因。1郾 3摇 细胞培养Hep3B 肝癌细胞系购买于中国医学科学院。细胞在 MEM 培养基中培养,添加 10%FBS 及 1%青-链霉素双抗,细胞置于 37 益,5%CO2孵箱中,细胞每 1 2 d 换液,镜下观察细胞汇合度达 80%85%时胰酶消化并传代,扩大培养,收集细胞用于后续实验。1郾 4摇 细胞转染待细胞生长融合度达到 50%左右时,对细胞进行转染,转染过程使用 Lipofectamine 3000(In鄄vit
15、rogen)转染试剂进行载体的导入。具体过程根据试剂说明书进行操作。转染试剂加入后,约 6 h后进行换液,并继续培养24 h,通过实时荧光定量PCR 检测敲低效率。si-circRNA_102272序列:5忆-CCGTCGAGCATCATTGGTT-3忆。1郾 5摇 荧光素酶报告基因实验将 野 生 型circRNA_102272和 突 变 型circRNA_102272序列(miR-1258 结合位点突变)克隆到质粒中并将质粒与 miR-1258 进行共转染。使用 Dual-Luciferase 报告基因检测系统(Promega)明确二者之间的结合。具体操作步骤按照试剂说明书进行,检测各实验组
16、荧光素酶活性变化。1郾 6摇 CCK-8 实验首先细胞转染 si-circRNA_102272或空白载体,转染后,细胞生长 24 h,进行 96 孔板铺板处理,3000 个细胞每孔。继续培养,待特定时间(48、72 h)向每孔加入 10 滋L CCK-8(Dojindo)溶液。将培养板在培养箱内孵育 2 h。用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。1郾 7摇 QPCR用 TRIzol 试剂(Invitrogen)提取总 RNA,环状 RNA 检测试剂盒购买自 Applied Biosystems Com鄄pany(Foster City,CA,USA)。GAPDH 作为内参。qPCR 采用 S
17、YBR Premix Ex Taq II 试剂盒(Takara)和 ABI7500 系统(Applied Biosystems)。qPCR 扩增条件按照试剂说明书进行。使用 2-驻驻Ct方法计算。circRNA_102272 引 物 序 列:F:5忆-GAGTGAGGAGAGATCCCCCTAAC-3忆 R:5忆-GGCATCAT82锦州医科大学学报摇 2023 年 8 月,44(4)GACGTCATCCGAATC-3忆;GAPDH 引物序列:F:5忆-GGATTTGGTCGTATTGGG-3忆;R:5忆-TCGCTC鄄CTGGAAGATGG-3忆。1郾 8摇 统计方法所有数据全部来自至少 3
18、 个独立的实验。数据采用独立样本 t 检验或单因素方差分析处理,以 P0郾 05),但是与患者的 TNM 分期,分化程度以及转移相关(P 55315性别-1郾 6800郾 095摇 摇 男219摇 摇 女48肿瘤大小(cm)-0郾 7560郾 450摇 摇 臆5318摇 摇 539分化程度2郾 0290郾 042摇 摇 中-高分化510摇 摇 低分化117远处转移2郾 1500郾 032摇 摇 无614摇 摇 有013TNM 分期2郾 2070郾 027摇 摇 玉+域59摇 摇 芋+郁1182郾 3摇 抑制circRNA_102272抑制肝癌细胞增殖为了进一步验证circRNA_102272对
19、肝癌细胞增殖的影响,我们在肝癌细胞中敲低circRNA_102272的表达,通过 CCK-8 验证circRNA_102272对肝癌细胞增殖活力的影响。首先在肝癌细胞中敲低circRNA_102272表达,见图 2A。进一步通过 CCK-8 实验发现,与对照组相比,在肝癌细胞中敲低circRNA_102272表达后肝癌细胞的增殖能力显著降低,见图 2B。2郾 4摇circRNA_102272通过吸附 miR-1258 抑制肝癌细胞增殖为了明确circRNA_102272在肝癌中发挥作用的机制,我们通过 circbase(http:/www郾 circbase.org/)以 及 circinte
20、ractome(https:/circinterac鄄tome郾 nia郾 nih郾 gov/index郾 html)预 测 其 可 能 机 制,见图 3A,circRNA_102272有可能与 miR-1258 结合,并且我们通过荧光素酶实验证实了二者之间的结合,见图 3B。同时在肝癌细胞中转染 si-miR-1258 质粒,能够逆转 si-circRNA_102272对肝癌细胞增殖的抑制作用,提示circRNA_102272对肝癌细胞增殖的调控是通过 miR-1258 实现的,见图 3C。A:qPCR 检测肝癌细胞中敲低circRNA_102272效率;B:CCK-8 检测敲低circRN
21、A_102272后肝癌细胞增殖能力被显著抑制;*P0郾 01,*P0郾 001,NS:no significant。图 2摇 敲低circRNA_102272抑制肝癌细胞增殖A:在线数据库预测 miR-1258 与circRNA_102272结合;B:荧光素酶实验证实 miR-1258 与circRNA_102272结合;C:转染 si-miR-1258 质粒逆转 si-circRNA_102272对肝癌细胞增殖的抑制作用;*P0郾 01;NS:no significant。图 3摇 circRNA_102272通过 miR-1258 抑制肝癌细胞增殖3摇 讨摇 摇 论多数肝炎患者最终可能会演
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