黄白耐克对耐药幽门螺杆菌感染大鼠氧化应激、肠道菌群及细胞因子的影响.pdf
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1、doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.08.012基金项目:河北省医学科学基金项目(20201255)第一作者简介:解志芳,主治医师,研究方向:消化系统疾病。E-mail:shiwozi80826 通讯作者:沈毅慧,硕士,主任医师,研究方向:消化系统疾病及内镜下诊疗。E-mail:xxx800809 ;李通,主任医师,研究方向:消化系疾病及内镜下诊疗。E-mail:hbbdsyh0312 黄白耐克对耐药幽门螺杆菌感染大鼠氧化应激、肠道菌群及细胞因子的影响解志芳1,沈毅慧2,李通31.华北石油管理局总医院消化内科,河北 任丘 062550;2.华北医疗集团峰峰总医院
2、消化内科;3.安国市医院消化内科【摘要】目的研究黄白耐克对耐药 H.pylori 感染大鼠氧化应激、肠道菌群及细胞因子的作用机制及治疗效果。方法SD 健康雄性大鼠 42 只,选取 10 只作为健康组,余 32 只给予 H.pylori 建立耐药 H.pylori 模型,其中 2 只大鼠建模过程中意外死亡,余 30 只模型大鼠采用数字随机法分为模型组、黄白耐克组(黄白耐克 6.268 g/kg,2 次/d,灌胃 14 d)及硫糖铝组(硫糖铝 4 g/kg,1 次/d,灌胃 14 d),每组 10 只。黄嘌呤氧化酶法检测 SOD,TBA 法检测 MDA,HE 染色及透射电镜观察各组大鼠胃黏膜病理形
3、态,免疫组化检测细胞因子 IL-6、TNF-表达,检测肠道菌群。结果与健康组相比,模型组大鼠血清中 SOD 降低,MDA、H.pylori 阳性率、胃黏膜评分、IL-6、TNF-升高(P0.05)。与模型组相比,黄白耐克组、硫糖铝组 SOD 升高,MDA、H.pylori 阳性率、胃黏膜评分、IL-6、TNF-降低(P0.05)。与健康组相比,模型组大肠埃希菌增加,变形杆菌、链球菌、革兰阳性菌减少(P0.05)。与模型组相比,黄白耐克组、硫糖铝组大肠埃希菌减少,变形杆菌、链球菌、革兰阳性菌增加(P0.05)。结论黄白耐克对耐药 H.pylori 感染大鼠 H.pylori具有清除作用,同时调节
4、肠道菌群降低氧化应激损伤,并可抑制 IL-6、TNF-等炎症水平表达。【关键词】黄白耐克;耐药幽门螺杆菌感染大鼠;氧化应激;肠道菌群;细胞因子中图分类号:R57;R378文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)08-0896-06收稿日期:2022-06-19Effects of Huangbai Nike on oxidative stress,intestinal flora and cytokines in drug-resistant Helicobacter pylori infected ratsXIE Zhifang1,SHEN Yihui2,LI Tong31.D
5、epartment of Gastroenterology,General Hospital of North China Petroleum Administration Bureau,Renqiu 062550;2.Department of Gastroenterology,Fengfeng General Hospital,North China Medical Group;3.Department of Gastroen-terology,Anguo Hospital,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism and t
6、herapeutic effect of Huangbai Nike on oxidative stress,in-testinal flora and cytokines in drug-resistant H.pylori infected rats.MethodsForty-two healthy male SD rats were se-lected,and 10 were used as the healthy group.The remaining 32 rats were given H.pylori to establish a model of resist-ant H.py
7、lori infection.Two rats died accidentally during the modeling process,and the remaining 30 model rats were randomly divided into model group,Huangbai Nike group(given Huangbai Nike at 6.268 g/kg,twice a day,gavege for 14 days),and Sucralfate group(given Sucralfate 4 g/kg,once a day,gavage for 14 day
8、s).The SOD activity was meas-ured by xanthine oxidase method,and MDA was measured through TBA method.HE staining and electron microscopy were used to observe the pathological morphology of the gastric mucosa in each group of rats.Immunohistochemistry was used to detect the expression of cytokines IL
9、-6 and TNF-,and intestinal flora was examined.ResultsCompared with healthy group,the SOD in serum decreased,and MDA,H.pylori positive rate,gastric mucosa score,IL-6 and TNF-increased in model group(P0.05).Compared with model group,SOD increased,and MDA,H.pylori positive rate,gastric mucosa score,IL-
10、6 and TNF-decreased in Huangbai Nike group and sulfoal group(P0.05).Compared with the healthy group,Escherichia coli increased and Proteus,Streptococcus and Gram-positive bacteria decreased in the model group(P0.05).Compared with the model group,Escherichia coli decreased and Proteus,Streptococcus a
11、nd Gram-positive bacteria increased in the Huangbai Nike group and sulfoal group(P8 mg/L、克拉霉素 MIC1 mg/L 判定为耐药。1.5模型建立、分组及干预42 只健康大鼠中随机选取 10 只 作 为 健 康 组,剩 余 32 只 大 鼠 建 立 耐 药H.pylori 感染 大 鼠 模 型,给 予 含 1 109 cfu/ml 耐 药H.pylori 的脑心浸液灌胃,每只每次灌胃 0.2 ml,隔日1 次,共 5 次10,其中 2 只大鼠建模过程中意外死亡,剩余 30 只模型大鼠采用数字随机法分为模型组
12、、黄白耐克组及硫糖铝组,每组 10 只。健康组和模型组大鼠给予 0.2 ml 生理盐水灌胃;黄白耐克组大鼠给予黄白耐克 6.268 g/kg,2 次/d,灌胃 14 d;硫糖铝组给予硫糖铝 4 g/kg,1 次/d,灌胃 14 d。1.6检测指标 1.6.1琼脂稀释法(Agar Dilution)测定黄白耐克对耐药 H.pylori 的 MIC 值:采用倍比稀释的方法,在 90 mm培养皿内配置不同浓度实验药物的细菌培养基,药物终浓 度 分 别 为 256 g/ml、128 g/ml、64 g/ml、16 g/ml;收集培养新鲜的耐药 H.pylori 置于脑心浸液中,稀释至 0.5 麦氏浊度
13、,1 l 接种环将细菌接种于含药琼脂平板表面,同时接种不含实验药物作为对照,接种后将平皿置于 37 微需氧环境培养 72 h 后观察结果,不出现菌落的琼脂平板上的最低药物浓度为其MIC 值。1.6.2检测各组大鼠氧化应激水平:干预结束禁食24 h 后,戊巴比妥钠麻醉取各组大鼠外周血 2 ml,注入促凝的采血管中,1 250 r/min 离心 5 min,取血清。实验步骤按说明书进行,黄嘌呤氧化酶法检测 SOD,TBA法检测 MDA。1.6.3H.pylori 检测:各组大鼠戊巴比妥钠麻醉处死后,提取胃组织采用无菌生理盐水去除胃内容物,进行798胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32
14、卷第 8 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8H.pylori 培养,培养 4 d,并挑取符合H.pylori 形态特征进行扩展培养,扩展 3 d 后采用触酶、氧化酶、尿素酶鉴定,涂片革兰氏 染色,以三 酶阳 性 并 且 涂 片 符 合H.pylori 形态的标本确定为 H.pylori 阳性。1.6.4HE 染色及透射电镜观察各组大鼠胃黏膜病理形态:胃黏膜组织于 4%甲醛中固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋及切片(4 m),行 HE 染色后于光学显微镜下观察并对胃黏膜损伤评分。胃黏膜损伤评分标准:1 分:黏膜正常;2 分:黏膜表层
15、细胞损伤;3 分:腺体细胞损伤;4 分:黏膜糜烂、出血或形成溃疡。透射电镜:取 1 mm1 mm 胃黏膜组织置于 4%戊二醛固定液中固定,经脱水、浸透、包埋、聚合、超薄切片及染色,于透射电镜下观察胃黏膜病理形态。1.6.5免疫组化检测细胞因子 IL-6、TNF-水平:取各组大鼠胃黏膜组织切片经脱蜡、水化、水洗后,封闭30 min。IL-6、TNF-抗体与 TBST 配比稀释(1200),滴于切片上以 PBS 作为阴性对照,置于湿盒中 4 过夜。室温放置 1 h 后清洗,滴加稀释的辣根过氧化物酶二抗(1500)37 孵育 30 min,树胶封片。采用DAB 法显色;依次干燥,95%乙醇、无水乙醇
16、脱水,透明、中性树胶封片;染色后,采用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统观察切片并摄片(棕褐色均染或颗粒判为阳性细胞)。显微镜下观察。对每张切片中阳性染色区域进行评估,并作等级评分。0 分:阳性染色面积50%75%;3 分:阳性染色面积75%100%。1.6.6黄白耐克对各组大鼠肠道菌群的影响:在处死大鼠前于肛门处挤出新鲜粪便放于无菌容器中送入我院检验科微生物室进行细菌培养和检测。1.7统计学方法采用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用配对 t 检验,多组内两两比较采用 SNK 法,计量资料以 xs 表示,P
17、0.05 为差异有统计学意义。2结果 2.1黄白耐克对耐药 H.pylori 菌株的平均 MIC 值琼脂稀释法显示,黄白耐克对 NCTC11637 的 MIC 值为2 mg/L(铋),对耐药 H.pylori 菌株的 MIC 值为 1 4 mg/L(铋),平均 MIC 值为 2.7 mg/L(铋),提示本实验成功培养克拉霉素耐药 H.pylori 菌株。2.2黄白耐克对大鼠氧化应激水平的影响与健康组相比,模型组大鼠血清中 SOD 降低、MDA 升高(P0.05)。与模型组相比,黄白耐克组与硫糖铝组大鼠SOD 升高、MDA 降低(P0.05,见表 1)。表 1各组大鼠氧化应激反应(xs,n=10
18、)Tab 1Oxidative stress reaction of rats in each group (xs,n=10)组别SOD/(U/mg prot)MDA/(mmol/mg prot)健康组52.674.284.250.36模型组31.812.1910.341.28黄白耐克组45.343.27#6.210.52#硫糖铝组46.133.24#6.170.54#F 值69.250113.100P 值0.0010.001注:与健康组对比,P0.05;与模型组对比,#P0.05。2.3黄白耐克对大鼠 H.pylori 清除的影响与健康组相比,模型组大鼠胃组织 H.pylori 阳性率升高(
19、P0.05)。与模型组相比,黄白耐克组与硫糖铝组大鼠胃组织 H.pylori 阳性率降低(P0.05,见表 2)。表 2各组大鼠胃组织 H.pylori 阳性率对比Tab 2Comparison of H.pylori positive rate in gastric tissue of rats in each group组别只数阳性阴性阳性率/%健康组100100模型组108280.00黄白耐克组104640.00#硫糖铝组103730.00#注:与健康组对比,P0.05;与模型组对比,#P0.05。2.4黄白耐克对大鼠病理形态的影响HE 染色:健康组大鼠胃黏膜组织结构正常;模型组可见黏膜
20、糜烂,表层上皮细胞受损,炎性细胞浸润;黄白耐克组和硫糖铝组黏膜上皮较为完整,表层上皮细胞受损,未见明显炎性细胞浸润。健康组大鼠胃黏膜损伤评分(1.120.11)分低于模型组(3.540.27)分(P0.05)。与模型组相比,黄白耐克组(2.37 0.24)分和硫糖铝组(2.480.18)分显著降低(P0.05)。透射电镜:健康组细胞结构正常;模型组线粒体及粗面内质网肿胀,微绒毛稀疏,酶原颗粒减少;黄白耐克组和硫糖铝组细胞结构损伤程度较模型组较轻,仍可见线粒体及粗面内质网肿胀(见图 1)。898胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastroenterol
21、 Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.8图 1各组大鼠胃黏膜病理组织形态(HE 染色,放大 200 倍,透射电镜,放大 1 200 倍)Fig 1Pathological morphology of gastric mucosa of rats in each group2.5黄白耐克对大鼠 IL-6、TNF-表达的影响健康组 IL-6、TNF-阳性表达低于模型组(P0.05)。模型组 IL-6、TNF-表达较硫糖铝组和黄白耐克组高(P0.05,见表 3、图 2)。2.6黄白耐克对大鼠肠道菌群的影响与健康组相比,模型组大鼠大肠埃希菌增加(P0.05),变形杆菌、链球菌、革兰阳
22、性杆菌减少(P0.05)。与模型组相比,黄白 耐 克 组 和 硫 糖 铝 组 大 肠 埃 希 菌 减 少(P 0.05),变形杆菌、链 球 菌、革 兰 阳 性 杆 菌 增 加(P 0.05,见表 4)。表 3各组大鼠胃组织 IL-6、TNF-阳性表达(xs,n=10)Tab 3Positive expression of IL-6 and TNF-in gastric tissues of rats in each group(xs,n=10)组别IL-6TNF-健康组18.921.4723.622.71模型组52.465.8761.373.75黄白耐克组25.242.13#37.512.54
23、#硫糖铝组24.852.16#36.842.61#F 值196.700285.000P 值0.0010.001注:与健康组对比,P0.05;与模型组对比,#P0.05。图 2各组大鼠 IL-6、TNF-的表达(免疫组化,放大 200 倍)Fig 2Expressions of IL-6 and TNF-in each group of rats表 4各组大鼠肠道菌群检测结果对比(xs,n=10)Tab 4Comparison of intestinal flora detection result of rats in each group(xs,n=10)组别大肠埃希菌/%变形杆菌/%链球菌
24、/%革兰阳性杆菌/%健康组59.315.1421.363.159.570.8615.261.31模型组84.287.355.140.493.150.204.140.30黄白耐克组67.815.26#16.351.42#7.950.72#13.681.25#硫糖铝组68.292.31#15.281.47#7.740.81#13.821.14#F 值38.300129.000155.800223.500P 值0.0010.0010.0010.001注:与健康组对比,P0.05;与模型组对比,#P0.05。998胃肠病学和肝病学杂志2023 年 8 月第 32 卷第 8 期Chin J Gastro
25、enterol Hepatol,Aug 2023,Vol.32,No.83讨论 3.1黄白耐克对耐药 H.pylori 感染大鼠细胞因子及H.pylori 的影响H.pylori 感染后会增加机体炎性因子 TNF-、IL-6 等的表达。其中 IL-6 可以抑制中性粒细胞的吞噬能力,导致组织细胞受损,还可催化炎症反应持续发生;TNF-可通过激活血管内皮细胞,促进多种细 胞 因 子 的 表 达,引 发 炎 性 细 胞 浸 润 和 炎 症 反应11。大量的炎症因子被释放会导致胃黏膜持续性的炎性损伤,进而引发胃炎等疾病。常见治疗 H.pylori 感染的方法为三联疗法,但随着抗生素滥用的增多,H.py
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