复合酶法提取花生蛋白的工艺优化及性能评估.pdf
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1、第 31 卷 2023 年 第 4 期 食品加工 69 DOI:10.16210/ki.1007-7561.2023.04.010 高凤,马赫,张文玉,等.复合酶法提取花生蛋白的工艺优化及性能评估J.粮油食品科技,2023,31(4):69-77.GAO F,MA H,ZHANG W Y,et al.Process optimization and functional determination of peanut protein by complex enzymatic extractionJ.Science and Technology of Cereals,Oils and Foods
2、,2023,31(4):69-77.复合酶法提取花生蛋白的 工艺优化及性能评估 高 凤,马 赫,张文玉,刘常金(天津科技大学 食品科学与工程学院,天津 300457)摘 要:采用多种酶对花生进行分步水解制备蛋白粉。以花生为原料,蛋白提取率为响应值,酶添加量、温度、pH 为实验因素,采用响应面建立数据模型,优化提取工艺,并将该条件下制备的蛋白粉和水提法、单一酶提取法制备样品与市售蛋白进行功能性对比,研究复合酶提取蛋白粉的粒径分布、溶解性、乳化性、表面疏水性的变化。结果表明:复合酶的最优酶解条件为酶添加量1.8%、反应温度 55、适宜 pH9.2,在此条件下蛋白提取率达到 89.21%。复合酶制备
3、的蛋白粉粒径分布均匀,颗粒物更小,蛋白溶解性和乳化性都显著提高。关键词:水酶法;微观结构;溶解性;乳化特性;表面疏水性 中图分类号:TS201.1;S-3 文献标识码:A 文章编号:1007-7561(2023)04-0069-09 Process Optimization and Functional Determination of Peanut Protein by Complex Enzymatic Extraction GAO Feng,MA He,ZHANG Wen-yu,LIU Chang-jin(College of Food Science and Engineering,T
4、ianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)Abstract:Peanuts were hydrolyzed step by step with various enzymes to prepare protein powder.Using peanuts as raw materials,protein extraction rate response value,enzyme addition amount,temperature,and pH as experimental factors,were u
5、sed to establish a data model to optimize the extraction process with response surface.The protein powder prepared under this condition was compared with the protein powder prepared by water extraction method,single enzyme extraction method and commercially available protein.The particle size distri
6、bution,solubility,emulsification and surface hydrophobicity of protein powder extracted by compound enzyme were studied.The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions of the complex enzyme were 1.8%enzyme addition,55 reaction temperature,and pH 9.2.Under these conditions,the pro
7、tein extraction rate reached 89.21%.The particle size distribution of the 收稿日期:2023-03-14 基金项目:天津市科技计划项目(19YFZCSN00560)Supported by:Tianjin Municipal Science and Technology Program(No.19YFZCSN00560)作者简介:高凤,女,1995 年出生,在读硕士生,研究方向为植物蛋白开发及应用。E-mail: 通讯作者:刘常金,男,1969 年出生,博士,副教授,研究方向为粮食油脂及植物蛋白工程。E-mail: 食品
8、加工 第 31 卷 2023 年 第 4 期 70 protein powder prepared by the complex enzymes was uniform,and the particles were smaller,indicating that the protein solubility and emulsification were significantly improved.Key words:hydroenzymatic method;eicrostructure;solubility;emulsification characteristics;surface h
9、ydrophobic 花生是我国重要的油料作物之一,其蛋白含量在 25%以上,营养价值与动物蛋白接近,约占世界蛋白质消费量的 11%1。花生中含有 8 种人体必需氨基酸2,还具有改善脑血管、抗癌等功效,被称为“长生果”3。但是,花生蛋白乳化性与水溶性较差,这大大限制了其在食品,尤其在饮料中的应用。酶工程技术是现代生物技术的重要组成部分,采用水酶法提取花生蛋白是以水作为媒介,经过破碎、提取、破乳和分离四个阶段,不使用有机溶剂,具有绿色环保、作用温和、安全等特点。目前水酶法提取工艺被广泛应用于棕榈4、向日葵籽5和油菜籽6等植物油提取。Chen 等7研究发现经纤维素酶处理后的花生细胞壁被破坏,油脂、
10、蛋白更易提取而不破坏蛋白质的功能性。李响等8用酶法、挤压膨胀与挤压协同酶法处理的花生蛋白聚集物减少,溶解性提高,蛋白的起泡性与乳化性也得到改善。Tirgarian 等9使用 Neutrase 与 Pectinex 复合两种酶制剂辅助水提取(EAAE)工艺提取芝麻油与蛋白水解物,得到的蛋白水解物具有更高的碳水化合物含量,pH4.0 是蛋白为最低的溶解度和乳化活性。李佳笑等10用高压均质与中性蛋白酶制备的蛋白粉提高了在酸性条件下的溶解度,提高蛋白在酸性饮料中的应用。水酶法提取蛋白的优势是利用酶解大分子,促进蛋白和油脂释放,有利于蛋白提取,水解液根据密度差异和蛋白与油脂对水的亲和力进行分离11,提高
11、蛋白的溶解性、乳化性等功能性质。目前水酶法提取植物蛋白大多采用单一的酶,采用复合酶制剂的研究比较少,本研究以多种酶分步水解花生蛋白,提高蛋白提取率,并优化试验,为花生蛋白的利用提供依据。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 山东鲁花 11 号花生:千禾花生合作社;市售花生蛋白粉:浙江多味生物科技有限公司;Celluclast 1.5 L 复合纤维素酶、Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶、Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶:诺维信公司;2709 碱性蛋白酶:庞博生物公司;氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠:天津索罗门生物科技有限公司;8-苯胺萘磺-1-酸盐(ANS):天津市江天化工技术股
12、份有限公司。上述所有试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备 FA22048 分析天平:上海佑科仪器仪表有限公司;K9860 凯氏定氮仪:海能仪器股份有限公司;FE28 精密酸度计:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ACHH-4 数显恒温水浴锅:常州普天仪器制造有限责任公司;HK-08 摇摆式粉碎机:广州市旭朗机械设备有限公司;BeNano 90 Zate 纳米粒度电位分析仪、Bettersize2600 激光粒度分析仪:丹东百特仪器有限公司;SU1510 扫描电子显微镜:日本日立公司;UV-1800 紫外分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;F-2500 荧光分光光度计:上海善福电子科技有限公司。
13、1.3 实验方法 1.3.1 酶制剂的筛选 选取 Celluclast 1.5 L 复合纤维素酶、Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶、Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶、2709 碱性蛋白酶四种酶对花生进行水解,参照最适宜条件进行实验,根据酶解条件 pH 确定分步酶解。1.3.2 花生蛋白的提取 取 20 g 花生以 15 的料液比混合后超声处理,60 碱提30 min,调节溶液pH选择Celluclast 第 31 卷 2023 年 第 4 期 食品加工 71 1.5 L 复合纤维素酶、Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶进行酶解,结束后沸水灭菌 15 min;再次调节溶液p
14、H 选择 Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶、2709 碱性蛋白 酶 进 行 第 二 步 酶 解,灭 酶 15 min,最 后4 000 r/min 离心 15 min,120 喷雾干燥收集蛋白粉密封保存。1.3.3 蛋白提取率的计算 花生蛋白含量采用微量凯氏定氮法12测定,提取率计算公式如下:12%100GG蛋白含量()式中:G1为水解液蛋白粉的蛋白质量(g);G2为花生蛋白质量(g)。1.3.4 复合酶提取工艺优化 固定第一步酶解条件,Celluclast 1.5 L 复合纤维素酶和 Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶的酶解温度45,pH6.5,时间 2 h,选择复合酶(Cel
15、luclast 1.5 L 复合纤维素酶Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶2709 碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L 碱性蛋白 酶=6564)的添加量、第二步酶解温度和pH 进行单因素工艺优化实验,在三个单因素实验基础下进行以蛋白提取率为指标的三因素三水平响应面优化实验,响应面因素与水平如表 1。表 1 Box-Behnken 实验设计因素与水平 Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design 因素 水平 酶添加量 A/%酶解温度 B/pH C 1 1.5 50 8.5 0 2.0 55 9.0 1 2.5 60 9.5
16、1.3.5 Zate 电位的测定 将蛋白粉溶解后稀释,用注射器将样液加入到 Zate 电位测量池中,由电位分析仪,在室温温度 25 条件下平衡 120 s 后对电位进行测定。1.3.6 粒径分布的测定 参照孙协军等13的方法测定花生蛋白粒径分布,取蛋白粉样品分散在蒸馏水中,室温磁力搅拌 2 h,将样品滴加到激光粒度分析仪的分散单元进行自动粒度测定,设置分散相与分散介质的折射率分别为 1.52 和 1.33,在分散器中搅拌,根据测定蛋白粉颗粒物的粒径大小以及粒径区间内颗粒物含量绘制粒径分布图。1.3.7 扫描电镜观察微观结构 取适量粉末样品分散在在导电胶上,用洗耳球吹平粉末铺开,进行喷金处理后,
17、在加速电压下扫描,收集图片。1.3.8 蛋白溶解性的测定 取 0.50 g 蛋白粉溶解于 PBS 缓冲液(pH7.0,0.1 mol/L),室温条件下磁力搅拌 1 h,4 000 r/min离心取上清液,用凯氏定氮法测蛋白含量,蛋白溶解度计算公式如下:12%WW蛋白溶解度()式中:W1为水溶液中蛋白含量(%);W2为蛋白粉蛋白含量(%)。1.3.9 蛋白乳化性和乳化稳定性的测定 参考 Zhang 等14的方法,并加以修改。取蛋白样品溶解于 PBS 缓冲溶液,配制一定质量浓度的蛋白溶液,取 10 mL 样品溶液与 20 mL 菜籽油在 50 mL 离心管中混合均匀,并在高速均质机中均质 1 mi
18、n,分别在均质结束后 0 min 和 10 min,在油液最底层取 50 L 分散在 SDS(0.1%,w/v)溶液中。在 500 nm 处测定吸光值 A0与 A10,乳化活性(EAI)与乳化稳定性(ESI)计算公式如下:20(22.303)()(1)10 000ANEAI m 010(%)100AESIA 式中:N 为稀释倍数;为蛋白质量浓度(g/mL);为体系油相所占比数;A0和 A10分别为 0 和 10 min 的吸光值。1.3.10 表面疏水性的测定 参考许英一等15的描述用 ANS 荧光探针法对花生蛋白表面疏水性进行测定。取一定量花生蛋白粉溶于 PBS 缓冲溶液中(pH7.0,10
19、 mmol/L),室温下磁力搅拌 30 min,4 000 r/min 条件下离心10 min,取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量,将蛋白样品稀释为 0.02、0.04、0.06、0.08 和0.1 mg/mL,分别取 4 mL 稀释液加 40 L ANS食品加工 第 31 卷 2023 年 第 4 期 72 (8 mmol/L)避光反应 1 h 后测定。荧光条件:激发波长 390、发射波长 470、狭缝宽度 5 nm。蛋白表面疏水性为荧光强度与蛋白浓度所得斜率。1.4 数据处理 实 验 数 据 用 origin 2022、Design-Expert.V8.0.6.1 进行作图,采用 IBM
20、SPSS Statistics 23对数据进行显著性分析,其中不同字母(a、b、c、d、e)表示显著差异(P0.05)。所有实验均为重复 3 次,结果用平均值标准偏差表示。2 结果与分析 2.1 酶制剂筛选效果 如表 2 所示,四种酶制剂的最适宜 pH 存在很大差异,根据 pH 确定工艺为分步酶解,Celluclast 1.5 L 复合纤维素酶和 Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶进行第一步酶解,2709 碱性蛋白酶和Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶为第二步酶解,根据表2 可知碱性条件下对蛋白提取率的影响较大,所以针对碱性条件下的酶解进行工艺优化。表 2 四种酶制剂酶解效果 Ta
21、ble 2 Enzymolysis effect of four enzyme preparations 酶种类 最适 pH 蛋白提取率/%2709 碱性蛋白酶 8.5 62.37 Neutrase 0.8 L 中性蛋白酶 7.0 32.35 Celluclast 1.5 L 复合纤维素酶 6.5 20.89 Alcalase 2.4 L 碱性蛋白酶 9.0 73.91 2.2 复合酶响应面结果分析 2.2.1 响应面分析方案、实验结果分析 响应面实验设计与结果见表 3,方差分析结果见表 4。利用 Design Expert 软件对表 3 中的实验结果进行回归分析,得到蛋白提取率对酶添加量(A
22、)、酶解温度(B)和 pH(C)的二次回归拟合方程:Y=88.70+4.37A+0.52B+2.67C1.05AB0.41AC 1.24BC4.66A27.30B22.03C2。从分析结果可以看出,该回归模型具有高度显著性(P0.000 1),改变蛋白提取条件对其提取率的影响有显著差异。失拟项不显著(P=0.088 5),说明该模型拟合度较好。回归系数 R2=表 3 Box-Behnken 实验设计方案与结果 Table 3 Box-Behnken design and corresponding experimental results 实验号酶添加量A/%酶解温度 B/pH C 蛋白提取率
23、Y/%1 1.5 50 9.0 71.41 2 2.5 50 9.0 80.67 3 1.5 60 9.0 74.91 4 2.5 60 9.0 79.97 5 1.5 55 8.5 74.22 6 2.5 55 8.5 85.36 7 1.5 55 9.5 79.48 8 2.5 55 9.5 88.99 9 2.0 50 8.5 74.67 10 2.0 60 8.5 77.82 11 2.0 50 9.5 83.40 12 2.0 60 9.5 81.59 13 2.0 55 9.0 89.42 14 2.0 55 9.0 88.59 15 2.0 55 9.0 89.43 16 2.0
24、 55 9.0 88.26 表 4 蛋白得率模型系数方差分析 Table 4 Analysis of variance of protein yield model coefficient 方差来源平方和 自由度均方 F 值 P 值 显著性模型 586.209 65.13 51.07 0.000 1*A 152.851 152.85 119.84 0.000 1*B 2.141 2.14 1.68 0.236 3NSC 57.201 57.20 44.85 0.000 3*AB 4.411 4.41 3.46 0.105 3NSAC 0.661 0.66 0.52 0.494 4NSBC 6.
25、161 6.16 4.83 0.064 0NSA2 91.471 91.47 71.71 0.000 1*B2 224.561 224.56 176.06 酶解 pH(C)酶解温度(B)。第 31 卷 2023 年 第 4 期 食品加工 73 2.2.2 复合酶提取条件的响应面优化分析 图 1 的等高线图和响应曲面更直观的表现酶添加量、温度、pH 三因素两两之间相互作用对蛋白提取率的影响,曲面的倾斜程度与影响成正比16。图中可以看出蛋白提取率随酶添加量与 pH 的增大而增大,而温度影响值是先增大后减小。由曲面图可以看出对蛋白提取率的影响因素大小关系为酶添加量(A)酶解 pH(C)酶解温度(B)
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