大鼠听泡原代成骨细胞分离培养及鉴定.pdf
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1、对S D大鼠听泡的原代成骨细胞进行分离培养及鉴定.方法选取只出生 h的S D乳鼠,从颞区无菌分离出听泡组织,经 胰蛋白酶和I型胶原酶消化后接种培养;待生长融合至 密度时,进行传代培养,于倒置显微镜下观察原代及传代成骨细胞的生长状态,并用E DU法分析其增殖趋势.对生长良好的细胞进行成骨诱导分化,并用A L P试剂盒和茜素红试剂盒进行染色分析,鉴定分化效果.结果大鼠听泡原代及传代成骨细胞培养中,细胞均贴壁良好、生长旺盛,第d分别可融合生长至、的密度,第d分别可融合生长至、的密度,形态呈现多样化.E D U法检测分析见:第d细胞增殖比均维持在较高水平,从第d起呈直线下降趋势.经诱导分化后,细胞生长
2、状态良好,形态依旧多样化,早期以梭形为主,中后期形态较为丰腴.分化后周,A L P染色见大量细胞胞质呈现深蓝色;第 d经茜素红染色便可见局部出现橙红色钙化结节.结论通过胰酶联合胶原酶两步消化法,成功地从S D乳鼠听泡中分离出原代成骨细胞,所得细胞生长及传代能力强,经诱导分化后具备良好的成骨活性,为鼓室硬化等疾病的体外研究提供可能.【关键词】大鼠;听泡;成骨细胞;鼓室硬化D O I:/j i s s n 网络出版时间:/:网络出版地址:h t t p s:/l i n k c n k i n e t/u r l i d/r 【中图分类号】R 【文献标识码】A【文章编号】()T h eP r i
3、m a r yO s t e o b l a s t s I s o l a t i o n,C u l t u r i n ga n d I d e n t i f i c a t i o n i nR a tO t o c y s tH u a n gY u,L i uD o u,H u a n gW e n x i a,L i a n gG e n t i a n(D e p a r t m e n t o fO t o l a r y n g o l o g y H e a da n dN e c kS u r g e r y,t h eT h i r dH o s p i t a l
4、o fW u h a n,W u h a n,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T oi s o l a t e,c u l t u r ea n di d e n t i f yt h ep r i m a r yo s t e o b l a s t s i nS Dr a to t o c y s t M e t h o d s T h eo t o c y s tw a s i s o l a t e da s e p t i c a l l yf r o mt e m p o r a l r e g i o no f s i x
5、S Dr a t sw h i c hw e r eb o r n i n h o u r s A f t e rd i g e s t i o nw i t h t r y p s i na n d t y p e I c o l l a g e n a s e,t h ep r i m a r yo s t e o b l a s t sh a db e e n i n o c u l a t e da n dc u l t u r e d W h e n t h ec e l l sg r e wa n df u s e dt o d e n s i t y,t h e yw e r e
6、s u b c u l t u r e d T h eg r o w t hs t a t u so fp r i m a r ya n ds u b c u l t u r e do s t e o b l a s t sw a so b s e r v e du n d e ri n v e r t e dp h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p e,a n dt h ep r o l i f e r a t i o nt r e n dw a sa n a l y z e db yE DUm e t h o d T h ec e l l sw i
7、 t hg o o dg r o w t hw e r eo s t e o g e n i c i n d u c e da n dd i f f e r e n t i a t e d A L Pk i ta n da l i z a r i nr e dk i tw e r eu s e df o r i d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t i a t i o ne f f e c t R e s u l t s I nt h ep r i m a r yc u l t u r ea n ds u b c u l t u r e d
8、o s t e o b l a s t so f r a t o t o c y s t,t h e c e l l sw e r ew e l l a d h e r e n t a n dg r e wv i g o r o u s l y T h e c e l l s c o u l d f u s e a n dg r o wt o a n d d e n s i t yo nt h es e c o n dd a y,a n d a n d d e n s i t yo nt h e f o u r t hd a y,r e s p e c t i v e l y,w i t hd
9、 i v e r s i f i e dm o r p h o l o g y I t s h o w e dt h a t t h ec e l l p r o l i f e r a t i o nr a t i om a i n t a i n e da t ah i g hl e v e l f r o md a yt od a y,a n das t r a i g h td o w n w a r dt r e n df r o md a yb yE DUt e s t A f t e r i n d u c e dd i f f e r e n t i a t i o n,t h
10、 ec e l l sg r e w w e l la n dd i v e r s i f i e di nm o r p h o l o g y I nt h ee a r l ys t a g e,t h ec e l l sw e r em a i n l ys p i n d l e s h a p e d,a n d i nt h em i d d l ea n d l a t e s t a g e,t h e c e l l sw e r ep l u m p A t w e e k sa f t e rd i f f e r e n t i a t i o n,a l a r
11、 g en u m b e ro f c e l l s s h o w e dd a r kb l u e c y t o p l a s mb yA L Ps t a i n i n g O nt h e t hd a y,l o c a l o r a n g e r e dc a l c i f i e dn o d u l e sw e r eo b s e r v e db ya l i z a r i nr e ds t a i n i n g C o n c l u s i o n T h ep r i m a r yo s t e o b l a s t sw e r e s
12、 u c c e s s f u l l y i s o l a t e d f r o mt h eo t o c y s t o fS Dr a t sb y t h e t w o s t e pd i g e s t i o nm e t h o do f t r y p s i na n dc o l l a g e n a s e T h eo b t a i n e dc e l l sh a ds t r o n gg r o w t ha n dp a s s a g ea b i l i t y,a n dh a dg o o do s t e o g e n i ca c
13、 t i v i t ya f t e ri n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n,听力学及言语疾病杂志 年第 卷第期J o u r n a l o fA u d i o l o g ya n dS p e e c hP a t h o l o g y V o l N o w h i c hl a i da f o u n d a t i o nf o r t h es t u d yo f t y m p a n o s c l e r o s i sa n do t h e rd i s e a s e s i nv i t r
14、 o【K e yw o r d s】R a t;O t o c y s t;O s t e o b l a s t s;T y m p a n o s c l e r o s i s鼓室硬化是指中耳粘膜下层及鼓膜固有层中出现透明样变性和钙质沉着等病理改变,多为中耳经历了长期的慢性炎症后,在愈合过程中所遗留的中耳结缔组织退行性变,其发病率国外报告为,国内为 .虽然各家报告不一,究其原因可能受解剖、遗传、免疫,等因素影响,因多发生在中耳慢性炎症之后,并可导致传导性听力下降,从而引起了众多学者的关注.笔者前期通过鼓室内注射耐甲氧金黄色葡萄球菌(MR S A)的方法成功诱发大鼠中耳炎症,最终钙质沉积形
15、成了鼓室硬化.但至今鼓室硬化的具体发病机制仍不明确,暂无有效的防治手段,目前临床上以手术治疗为主,但无法阻止鼓室硬化的进展,且远期疗效欠佳,因此探索鼓室硬化的发病机制对其防治具有重要意义.在骨代谢中,由前体细胞/基质细胞产生的护骨素(O P G)和 核 因 子 B受 体 活 化 因 子 配 体(R ANK L)是两个重要参与者,其中R ANK L可以刺激破骨细胞的分化、活性以及抑制破骨细胞的凋亡,从而促进骨质的破坏和吸收;而O P G可以抑制破骨细胞的分化和活性,促进成骨细胞增殖分化.骨质重塑的过程包括钙质释放、骨质吸收和钙质沉积、新骨形成,这一过程由成骨细胞和破骨细胞共同调节,以此来决定骨质
16、重塑的方向.鼓室硬化的形成通常经历炎性渗出、透明样变和钙化形成三个阶段,即其从发生起便是向着中耳腔内钙质沉积的方向发展,类似于骨代谢的成骨过程.此外,黄宏明等研究发现,鼓室硬化过程中O P G的表达水平及O P G/R ANK L的比值均明显升高,考虑可能通过O P G/R ANK L调节成骨细胞/破骨细胞从而向着钙质沉积和骨形成发展.但要证实成骨细胞增殖分化调控在鼓室硬化中的作用,需对大鼠听泡成骨细胞进行分离培养,才能便于进一步干预研究.基于这一点,本实验对大鼠听泡的原代成骨细胞进行分离培养及鉴定,报告如下.材料与方法 实验动物由三峡大学提供S P F(s p e c e f i cp a
17、t h o g e nf r e e)级、出生 h的S D乳鼠只,全部通过湖北省疾病预防控制中心质量检测 许可证号:S C X K(鄂),NO ,具备科学研究条件.所有操作均通过武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)动物伦理委员会审批.实验试剂及仪器DMEM低糖培养基(G i b c o)、特级胎牛血清(G i b c o)、双抗(G i b c o)、胰蛋白酶(G i b c o)、胶原酶I(S i g m a)、甘油磷酸钠(S i g m a)、L 维生素C(S i g m a)、地塞米松(S i g m a)、DM S O(S i g m a)、E DU检测试剂盒(碧云天)、A L P染
18、色试剂盒(S o l a r b i o)、茜素红染色试剂盒(百奥莱博)、C O培养箱(T h e r m oS c i e n t i f i c)、超净台(蓟州智净)、倒置荧光显微镜(O l y m p u s)、低速离心机(湘仪).大鼠听泡成骨细胞原代分离培养将出生 h的只S D乳鼠予以脱臼法处死,于 乙醇中放置m i n,无菌操作下从双侧颞区完整取出听泡组织,用DMEM L培养基清洗遍,然后用眼科剪将其剪碎成mm大小碎块,加入m l的 胰酶,于 C O培养箱中孵育消化 m i n,后加入等体积的含 胎牛血清的DMEM L培养基(即 F B S培 养 基)终 止 消 化,r/m i n离
19、 心m i n,弃上清;再加入m l胶原酶I,同样孵育消化 m i n,后加入等体积的 F B S培养基终止消化,r/m i n离 心 m i n,弃 上 清.加 入 少 许 F B S培养基重悬细胞沉淀后,于显微镜下计数,将浓度调整为/m l,取 m l接种至 c m培养瓶中,隔天换液一次.大鼠听泡成骨细胞鉴定 听泡原代及传代成骨细胞生长状态观察倒置显微镜下观察大鼠听泡原代成骨细胞形态及长势,待细胞贴壁生长融合至 的密度时,加入m l的 胰酶,于 C O培养箱中孵育消化m i n,显微镜下观察见绝大部分细胞变圆悬浮后,加入等体积 F B S培养基终止消化,r/m i n离心m i n,弃上清
20、,加入少许 F B S培养基重悬细胞沉淀后,于显微镜下计数,将浓度调整为/m l,各取m l接种至多个 c m培养瓶中进行传代培养,于倒置显微镜下观察大鼠听泡传代成骨细胞形态及长势,隔天换液一次.听泡成骨细胞增殖检测待传代成骨细胞再次贴壁生长融合至 的密度时,用上述相同方法按照/c m的密度将其传代接种至 孔板中,传代生长的一周内,按照E DU检测试剂盒说明书依次进行E DU标记、细胞固定、A p o l l o染色及D NA染色,然后于倒置荧光显微镜下进行荧光拍照观察,蓝光激发为活性细胞总数,红光激发为增殖细胞总数,计算成骨细胞每日的增殖比,分析增殖趋势.听力学及言语疾病杂志 年第 卷第期J
21、 o u r n a l o fA u d i o l o g ya n dS p e e c hP a t h o l o g y V o l N o 听泡成骨细胞碱性磷酸酶(A L P)染色分析用上述相同方法按照/孔的密度将大鼠听泡成骨细胞传代接种至 孔板中,显微镜下观察细胞生长状态良好,遂进行成骨诱导分化.甘油磷酸钠、L 维生素C及地塞米松溶解后,加入含血清培养基混 匀 配 制 成 诱 导 分 化 液,浓 度 分 别 调 至 mm o l/L、g/m l和 m o l/L.将生长良好的细胞培养基更换为诱导分化培养基,按照A L P染色试剂盒说明书进行A L P染色,然后于倒置显微镜下观察
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- 大鼠 听泡原代成骨 细胞 分离 培养 鉴定
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