从基础研究到临床实践:调节性T细胞在移植免疫耐受中的应用研究进展.pdf
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1、调节性 T 细胞(Treg)是机体建立免疫耐受的重要抑制性免疫细胞,在调控机体过度免疫应答和自身免疫性疾病中发挥着重要作用。在移植免疫耐受相关研究中,增加体内 Treg 数量或增强其功能已被证明是一种能够诱导移植免疫耐受的治疗策略。目前,基于 Treg 诱导移植免疫耐受的方法包括过继输注 Treg、体内扩增 Treg 和利用抗原特异性 Treg。本文对 Treg 的特征及其作用机制,基础实验最新研究进展及国内外与移植免疫耐受相关的 Treg 临床实践进行综述,并对 Treg 治疗未来的挑战与发展进行展望,旨在揭示 Treg 在移植免疫耐受相关研究中的重要性和应用前景,探讨 Treg 治疗策略的
2、优势和局限性,并为今后该领域的研究提供参考依据和启示。【关键词】免疫耐受;调节性 T 细胞(Treg);器官移植;细胞疗法;白细胞介素-2;嵌合抗原受体(CAR);细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4(CTLA-4);移植物抗宿主病【中图分类号】R617,R392.4【文献标志码】A【文章编号】1674-7445(2023)05-0016-09Advances in application of regulatory T cells in transplant immune tolerance:from basic to clinical research Hu Lu*,Nian Yeqi.*Th
3、e First Central Clinical College of Tianjin Medical University,Tianjin 300041,ChinaCorresponding author:Nian Yeqi,Email:【Abstract】RegulatoryTcells(Treg)areimportantinhibitoryimmunecellstoestablishimmunetolerance,whichplayapivotalroleinregulatingexcessiveimmuneresponseandautoimmunediseasesofthehost.P
4、reviousstudiesrelatedtotransplantimmunetolerancehaveconfirmedthatincreasingthenumberofTregin vivoorenhancingthefunctionofTregserveasatherapeuticstrategytoinducetransplantimmunetolerance.Atpresent,Treg-basedinductionmethodsfortransplantimmunetoleranceincludeadoptiveinfusionofTreg,in vivoamplification
5、ofTregandutilizationofantigen-specificTreg.Inthisarticle,thecharacteristicsandmechanismofTreg,thelatestresearchprogressonbasicexperimentsand clinical practice of Treg related to transplant immune tolerance at home and abroad were reviewed,and futurechallengesanddevelopmentofTregtherapywereprospected
6、,aimingtounravelthesignificanceandapplicationprospectofTregintransplantimmunetolerance,exploretheadvantagesandlimitationsofTregtherapeuticstrategies,andprovidereferenceandevidenceforsubsequentresearchinthisfield.【Key words】Immune tolerance;Regulatory T cell(Treg);Organ transplantation;Cell therapy;I
7、nterleukin-2;Chimericantigenreceptor(CAR);CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4(CTLA-4);Graft-versus-hostdisease1995 年,日本学者 Sakaguchi 等1首次发现在小鼠体内存在着一种 CD25+T 细胞在调节免疫稳态中发挥 着 关 键 作 用,并 将 其 命 名 为 调 节 性 T 细 胞(regulatoryTcell,Treg),随后鉴定了其关键转录DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023049基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(82101
8、874)作者单位:300041天津,天津医科大学一中心临床学院(胡露);天津市第一中心医院肾移植科(粘烨琦)作者简介:胡露(ORCID:0009-0007-9781-9635),硕士研究生,研究方向为移植免疫耐受与排斥反应,Email:通信作者:粘烨琦(ORCID:0009-0002-0915-9651),医学博士,研究方向为移植免疫耐受与排斥反应,Email:第 14 卷第 5 期器官移植Vol.14No.52023 年 9 月Organ TransplantationSep.2023因子叉头盒 p3(forkheadboxp3,Foxp3)2。尽管表达 CD4+CD25+Foxp3+的 T
9、reg 只占循环淋巴细胞的1%2%,但他们对维持机体免疫平衡和诱导免疫耐受至关重要3。研究表明,Treg 能够延缓或防止排斥反应,可作为移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease,GVHD)和排斥反应新的治疗手段4-5。此外,关于 Treg 降低异种移植排斥反应的研究也有报道6,如果其能成功应用,未来有望解决器官短缺问题。目前全球有多项临床试验正在研究 Treg 治疗在实体器官移植中的应用,尽管这些试验取得了较为乐观的阶段性结果,为 Treg 治疗的安全性及有效性提供了依据,但是 Treg 扩增技术的标准化和扩增后的稳定性还有待改进,利用基因组工程获得抗原特异性 Treg
10、 仍有待优化。本文就 Treg 在移植免疫耐受中的基础和临床应用研究进展做一综述。1Treg 在移植免疫耐受中的作用与机制1.1 Treg 的特征性分子体内的 Treg 群根据起源部位可分为在胸腺中发育的 Treg 和由外周 T 细胞转化而来的外周诱导Treg。这两类细胞有一些相似之处7,如它们都表达Foxp3,并且都是效应 T 细胞活化和增殖的有效抑制细胞。Foxp3 是目前应用最为广泛的 Treg 特异性标志物8,CD4+CD25+Foxp3+被认为是 Treg 独特的核心表型。但是不少研究者认为只根据 Foxp3 表达不足以建立 Treg 系,Treg 特异性 CpG 岛低甲基化模式被认
11、为是特异性更高的 Treg 生物标志物9,包括 Foxp3、细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4,CTLA-4)、肿瘤坏死因子受体和 Helios 等标志性基因的低甲基化10,其水平独立于 Foxp3 的表达。Treg 也可以根据另一种膜标志物 CD45RA 的表达与细胞的功能相结合进行分类,可以分为 3 个功能不同的亚群:具有高增殖潜力的幼稚静止态 Treg(Foxp3lowCD25lowCD45RA+,restingTreg,rTreg),终末分化的、低增殖潜力的激活态 Treg(Foxp3highCD25high
12、CD45RA,activatedTreg,aTreg)和分泌细胞因子的非 Treg(Foxp3lowCD45RA)11。大多数aTreg 来源于 rTreg,一旦受到抗原刺激,rTreg 就会增殖并上调 Ki-67 和 Foxp3 基因表达11。此外,Treg 表面的 CD127 与 Foxp3 的表达呈负相关,可与CD25 一起作为 Treg 的标记表型用于 Treg 的纯化12。Lam 等13通过体外扩增系统发现,Treg 中转录因子 Helios 高表达的丧失和中间型 Helios 表达群体的出现与 Treg 的不稳定性相关,表明 Helios 的表达可能是维持 Treg 谱系稳定性的重
13、要标志。1.2 Treg 的作用机制Treg 除了亚群的多样性外,它们的作用机制也有多样性。Treg 的抗炎和免疫抑制作用的基本机制可大致分为两种类型14,一是由 Treg 本身引发的对靶细胞的效应(直接机制),二是通过影响第三方的细胞或者因子进而影响靶细胞(间接机制)。直接机制包括:Treg 可以通过 CTLA-4、淋巴细胞活化基因3 等途径直接抑制抗原提呈细胞(antigen-presentingcell,APC)的成熟和功能;通过分泌免疫抑制因子如白细胞介素(interleukin,IL)-10、IL-35 和转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-途径
14、抑制体内 T 细胞活化与增殖;此外,研究发现Treg 内高水平表达环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate,cAMP)15,可通过缝隙连接转移到效应 T 细胞内,cAMP 可抑制活化 T 细胞核因子和IL-2 的转录,进而抑制效应 T 细胞;Treg 还可通过细胞毒素颗粒酶和穿孔素、Fas/Fas-L 途径、半乳糖凝集素-9/黏蛋白结构域分子-3 途径诱导靶细胞凋亡。间接机制包括:Treg 通过高表达 IL-2 受体CD25 竞争性消耗 IL-2,从而抑制效应 T 细胞的增殖;在 Treg 上表达 CD39 和 CD73 可介导消耗微环境中的三磷酸腺苷(adenos
15、inetriphosphate,ATP),进而生成具有免疫抑制作用的腺苷和单磷酸腺苷。重要的是,在许多情况下治疗性 Treg 不需要直接接触效应 T 细胞来发挥抑制功能,Treg 许多抑制活性的方式可以以抗原非特异性的形式发挥作用,称为“旁观者抑制效应”,这种效应允许它们抑制不同特异性的效应 T 细胞16。Treg 还可以通过产生免疫抑制分子来调节组织微环境,促进其他免疫抑制细胞群的出现,如具有不同特异性的 Treg、髓源性抑制细胞和其他抑制性 T 细胞亚群,这种现象被称为“感染耐受性”17。通过这种感染耐受性,即使治疗输注的Treg 不能无限期地存活,但其治疗效果将会被放大和延长。除上述机制
16、外,Treg 似乎在特定的免疫情况、不同的抗原刺激或微环境中对不同的细胞有着独特的抑制机制。程序性细胞死亡蛋白 1(programmedcelldeathprotein1,PD-1)是一种重要的免疫抑制分子,746器官移植第 14 卷其功能已被广泛研究,然而其在 Treg 中的作用仍未阐明。有研究者观察到 Treg 以抗原特异性的方式通过程序性细胞死亡蛋白配体 1(programmedcelldeathprotein-ligand1,PD-L1)直接抑制自身反应性 B 细胞,导致其凋亡,从而防止有害的自身抗体产生18。此外,T 细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域蛋白(Tcellimm
17、unoreceptorwithimmunoglobulinandimmunoreceptortyrosine-basedinhibitorydomain,TIGIT)是一种新型免疫检查点,其在 Treg 中高表达并可抑制一系列免疫细胞,包括 T 细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞。Treg 中 TIGIT 的上调与 TIGIT 基因座的低甲基化和 Foxp3 结合增加有关19-20。除此之外,已证明 Treg 可以促使单核细胞偏向分化为M2 型巨噬细胞,抑制单核细胞向促炎型 M1 型巨噬细胞分化21,还可直接作用于单核细胞,抑制其细胞因子分泌、细胞分化和抗原提呈功能。2Treg 在移植免疫耐受中的
18、基础与临床研究探索移植免疫耐受是指将供者组织、器官移植给受者后,在不使用免疫抑制药的情况下,受者免疫系统对同种异体移植物不产生排斥反应,但对其他抗原的应答保持正常。为了获得免疫耐受性,应调整体内Treg 和效应 T 细胞之间的平衡。这种 T 细胞平衡可以通过增加体内 Treg 的数量或增强其抑制活性来实现,同时也可减少效应 T 细胞的数量或减弱其效应活性22。Treg 疗法被认为是一种临床上可使用的预防排斥反应和诱导同种异体移植免疫耐受的有效方法23。目前基于 Treg 的免疫耐受诱导策略包括过继输注 Treg、体内扩增 Treg 和利用抗原特异性 Treg 进行诱导。2.1 过继输注 Tre
19、gTreg 过继输注治疗即分离提纯受者体内的Treg 并在体外进行扩增,形成多克隆 Treg 群,达到治疗目标数量后,再回输到受者体内,从而达到防止排斥反应的目的。早在 2004 年,在小鼠模型中进行的骨髓移植联合术后输注 Treg 就成功诱导了小鼠对于移植骨髓的长期耐受性24。该实验的成功不仅再次证明了 Treg 在移植免疫耐受中的重要性,而且还证实了 Treg 过继输注治疗在改善 GVHD 和预防排斥反应中的作用。目前,大多数从外周血中分离 Treg 的方案都使用白细胞分离术,然后在 CD127 低表达的基础上,连续富集 CD25+群体得到 Treg25。富集得到的 Treg 既可进行特异
20、性扩增也可进行非特异性扩增。进行非特异性扩增时,一般通过磁激活细胞分选法进行细胞纯化,如通过抗 CD3 和抗 CD28 磁珠刺激,扩增得到多克隆 Treg26。在扩增条件中添加西罗莫司(雷帕霉素),已被证明可促进 Treg 的稳定性,并且使 Treg 扩增优先于其他细胞27。此外,与新鲜分离的 Treg 相比,离体扩增的 Treg 更具免疫抑制性28,进一步支持了体外扩增的必要性。在一项跨越 5 个国家、8 个移植中心的多中心单臂临床试验中,研究了肾移植中的调节细胞疗法(ONE 研究),结果显示与使用标准免疫抑制方案治疗的对照组相比,细胞治疗组并没有显示出安全性问题,并且感染率也较低,表明多克
21、隆 Treg 能够成功用于治疗肾移植受者23,证明了过继输注 Treg 是可应用于临床的。Brook 等29在部分 ONE 研究工作的基础上,在肾移植受者中进行了 Treg 过继输注治疗的 2b 期随机对照试验。经过对 CD8+细胞的剔除和 CD25+细胞的富集,提取到了受者外周血中约75%的 Treg,再利用 IL-2、雷帕霉素、抗 CD3 和抗CD28 磁珠进行多轮刺激,最终得到了扩增的多克隆Treg。实验组受者在移植术后输注剂量为(510)106/kg 的多克隆 Treg,与进行标准免疫抑制方案治疗的对照组相比,降低了排斥反应的发生率、减少了维持阶段的免疫抑制药的使用剂量,该研究结果证明
22、了 Treg 疗法的疗效,并提供了 Treg 治疗安全性的进一步证据。此外,在一项前瞻性队列研究中30,研究者纳入了 31 例患者,19 例患者在肾移植术后接受标准免疫抑制治疗(参考队列),其治疗方案包括巴利昔单抗诱导以及应用他克莫司、吗替麦考酚酯和泼尼松进行免疫抑制维持治疗;12 例患者在肾移植术后接受扩增的自体 Treg 输注治疗(Treg 治疗队列),Treg 治疗队列不接受巴利昔单抗诱导,并且减少了免疫抑制药的使用。最终观察到,与参考队列相比,Treg 治疗队列的急性排斥反应发生率较低(21.1%比 0),并且 BK 病毒或巨细胞病毒感染率也较低。该研究不仅提示了 Treg 治疗是一种
23、有效的方法,还提出了未来门诊日间输注 Treg 产品的可能性。然而,现阶段大多数基于 Treg 过继输注治疗的实体器官移植临床试验仍处于起步阶段,并且尽管已经确定了人类 Treg 的多个标志物,但目前大多数Treg 疗法都集中在表型为 CD4+CD25+CD127 的同质Treg 群上,对于其他标志物考虑较少,没有区分它第 5 期胡露等从基础研究到临床实践:调节性T细胞在移植免疫耐受中的应用研究进展747 们的细胞异质性。此外,尽管早期临床试验报道了各种不同的细胞产品制造程序,并且都具有较好安全性,但是对于 T 细胞的选择和扩增方案仍具有较大的异质性,目前尚缺乏一套统一的扩增工作流程指南26。
24、因此,Treg 过继输注疗法广泛应用于临床仍有较多的工作尚待完成。2.2 利用 IL-2 体内扩增 Treg与体外扩增 Treg 相对应的另一种策略是体内诱导 Treg 的增殖。IL-2 对于 Treg 的生成、存活、稳定和功能至关重要31,Treg 对 IL-2 表现出较高的亲和力。并且越来越多的研究表明将低剂量的 IL-2 用于治疗免疫相关疾病,引起的不良反应较轻32。体内扩增 Treg 的基本思想是注射低剂量 IL-2,目前低剂量IL-2 已被成功用于 GVHD 的治疗33。低剂量 IL-2 主要激活表达高亲和力受体的 Treg,但在高剂量下也可以激活 CD8+T 细胞和自然杀伤细胞。W
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