地黄饮子加减方对APP_PS1双转基因痴呆小鼠行为学及突触可塑性相关蛋白的影响.pdf
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1、论著地黄饮子加减方对 /双转基因痴呆小鼠行为学及突触可塑性相关蛋白的影响谢芳 周兰【摘要】目的 观察地黄饮子加减方对/双转基因痴呆小鼠行为学及海马突触可塑性相关蛋白的影响探讨地黄饮子加减方保护海马神经元及改善海马突触可塑性可能作用机制 方法 将 只/痴呆小鼠随机分为模型组、模型西药组(盐酸多奈哌齐片)、模型中药组(地黄饮子加减方)每组各 只另将 只 小鼠设为空白组 水迷宫、旷场实验检测各组小鼠行为学 染色、尼氏染色检测各组小鼠海马神经元数量差异免疫荧光检测各组小鼠、表达情况结果 与模型组比较模型中药组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短、穿越平台次数增加(.)与模型组比较模型中药组小鼠进入中央区次数及中
2、央区活动时间明显增加(.)与模型组比较模型中药组小鼠海马神经元损伤情况得到明显改善与模型组比较模型中药组小鼠海马突触可塑性相关蛋白、荧光表达明显增强 结论 地黄饮子加减方可改善痴呆小鼠学习记忆能力改善痴呆小鼠神经元损伤增强海马神经元突触可塑性相关蛋白表达从而起到防治痴呆的作用【关键词】地黄饮子加减方 阿尔茨海默病 学习记忆能力 突触可塑性中图分类号 文献标识码:././.:.【】/./()().(.).(.).【】阿尔茨海默病()即老年性痴呆属于慢性、进行性及获得性的认知障碍不但表现为智能减退且伴有不同程度的人格改变是老年人最常见的痴呆病因其发病人数多约占痴呆总人数的/是现公共卫生最紧迫的挑战
3、之一 研究发现目前全球约有 万的痴呆患者 基金项目:蚌埠医学院自然科学重点项目()作者单位:安徽蚌埠蚌埠医学院第一附属医院 通信作者:周兰:.且预计到 年全球痴呆发病人数高达 万给家庭、社会带来极大经济负担和思想压力我国也将面临高额 治疗费用 学习记忆是指大脑各神经元、突触之间相互作用及相关联系而形成的复杂生物活动属于大脑高级活动 突触可塑性是指可调节性的神经系统细胞间的信息传递包括突触结构、传递效能的改变 二者之间互相影响、关系密切突触可塑性是学习记忆发生改变的物质基础而学习记忆能力提高又可促进突触数量、体积及面积等的增加进而形成新的神经回路 研究显示突齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .
4、触可塑性具有随外部环境改变特性以维持内部环境的相对稳定性其作为独特的神经网络可能与学习记忆关系密切 神经元损伤、神经细胞及突触数量减少被认为是 发病 的 神 经 病 理 学 基 础 等认为突触数量减少突触可塑性相关蛋白如生长相关蛋白()、突触后致密物()、突触素()等水平下降、突触结构模糊、突触效能降低、突触间隙增大是学习记忆能力降低产生的重要因素其与 认知功能障碍程度呈正相关 因此通过提高突触可塑性功能减轻神经元损伤可能是防治 的有效治疗措施目前地黄饮子通过改善学习记忆能力、提高突触可塑性功能在/动物模型方面的研究较少其潜在作用机制尚不明确 本研究运用地黄饮子加减方干预/痴呆小鼠探讨地黄饮子
5、加减方对 神经突触可塑性改善作用及其机制以期为 防治提供详实的实验数据支持一、材料与方法.实验材料:()实验动物:选择 月龄清洁级 小鼠体重()雄性 只 月龄 级/小鼠 只购自北京斯贝福生物技术有限公司(京)饲养于蚌埠医学院动物实验中心 分笼饲养每笼 只室温(.)湿度(.)严格按照蚌埠医学院动物实验中心要求的对动物护理、使用规则完成实验中的所有操作并给予实验动物人道主义关怀 动物实验的开展得到了本院动物实验伦理委员会批准(批号:伦动科批字 第 号)()实验药物与试剂:所用地黄饮子为加减方剂是由古代经典名方地黄饮子去附子去肉桂变桂枝加人参、血竭等药物化裁而成全方具有开窍、化痰、补肾、活血的功效
6、药材购自蚌埠医学院第一附属医院药材合格且符合 版中华人民共和国药典中记载的中药材标准 在蚌埠医学院动物实验中心以纯净水配置成等成人剂量水煎液体含生药量./冷藏保存备用 盐酸多奈哌齐片由卫材(中 国)药 业 有 限 公 司 制 造 批 准 文 号:用纯净水配置成含药量为./的溶液 冷藏备用 无水乙醇、甲酚紫(中国国药公司货号分别为、)冰醋酸(中国科密欧公司货号)多聚甲醛、戊二醛(中国 公司货号分别为、)二甲苯、柠檬酸钠(中国阿拉丁公司货号分别为 、)牛血清白蛋白 ()(公司货号)即用型 染液(凯基生物公司货号)一抗:、(公司货号分别为、)二抗:()(公司货号)()实验仪器及设备:水迷宫装备(德国
7、 公司)组织脱水(浙江金华科迪仪器设备有限公司)石蜡包 埋()切 片 机()摊片机()显微镜()全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司)电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)微型离心机()紫外分光光度仪()高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)电泳仪(北京六一生物科技有限公司)旋涡混合器(常州越新仪器制造有限公司).方法:()实验分 组 及 给 药:空 白 对 照 组 小鼠 只将 只/小鼠随机分为模型组、西药组、中药组共 组每组各 只 给药方法:空白组、模型组小鼠用纯净水 /灌胃 次/中药组小鼠分别按体重用含生药量分别为./地黄饮子中药汁灌胃 次/西药组小鼠以./
8、盐酸多奈哌齐片溶液灌胃 次/给药结束后每组随机取 只用于实验指标的检测()水迷宫实验:水迷宫设备检测区域避光、周围安静水温保持在 左右 测试前一天对每只小鼠进行 适应性游泳训练 实验小鼠需完成定位航行实验、空间探索实验两项检测 定位航行实验:定位航行实验进行 每只小鼠每天训练 次每次 记录小鼠找寻到安全平台需要的时间(逃避潜伏期)若小鼠在 内发现安全平台则允许小鼠在安全平台上站立 若小鼠在 之内未能找到安全平台则将小鼠引至安全平台上站立 其潜伏期记录为 逃避潜伏期越短则表明小鼠学习能力越好 空间探索实验:第 天将安全平台撤除让小鼠凭记忆找寻安全平台的位置 记录每只小鼠 内经过安全平台位置的次数
9、 小鼠穿越平台次数越多则表明学习能力越强()旷场实验:旷场实验装置为内壁和底面为白色、内径为 的敞箱被分割为面积相等的 个小格子中间 格为中央区域其余 格为外周区域 旷场实验上方安置红外摄像头记录小鼠 内进入中央区域次数及活动时间每只小鼠重复检测 次 每只小鼠实验结束后清理残留物并使用 酒精擦拭旷场实验装置以防对后续实验小鼠造成影响 患者常有一定程度的精神焦虑状态并伴随着自发活动能力与探索行为能力的衰减 旷场实验是检测动物焦虑程度、自发活动与探索行为能力的有效设施小鼠在旷场中央区的活动时间反映其焦虑程度中央区活动时间越长则反映小鼠焦虑程度越低()取材:水迷齐齐哈尔医学院学报 年第 卷第 期 .
10、宫实验及旷场实验完成后小鼠摘取眼球取血后分离血清(离心 /)小鼠断头处死后在冰台上迅速开颅取脑每组取出 个全脑置于中性福尔马林固定液里固定 其余小鼠大脑剥离海马和脑组织放置于液氮罐中备用()染色:取动物组织样本固定:中性福尔马林固定 脱水:乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯浸蜡包埋切片 脱蜡:二甲苯、二甲苯水化:无水乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、自来水冲洗染色:苏木精染液浸染、自来水冲洗分化:盐酸乙醇、自来水冲洗蓝化:弱氨水溶液反蓝、蒸馏水冲洗染色:.伊红染液浸染脱水:乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯封片:中性树胶封片、镜下观察拍照()尼氏染色:取
11、动物组织样本固定:中性福尔马林固定 脱水:乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯浸蜡包埋切片 脱蜡:二甲苯、二甲苯水化:无水乙醇、乙醇、乙醇、乙醇、自来水冲洗染色:焦油紫染液浸染、自来水冲洗脱色:乙醇脱水:乙醇、乙醇、无水乙醇、无水乙醇透明:二甲苯、二甲苯封片:中性树胶封片镜下观察拍照()免疫荧光法检测突触可塑性相关蛋白表达:取处理后的细胞用 多聚甲醛固定 .通透 经 在 下封闭 后分别用()、()和()抗体在 下孵育过夜洗涤后滴加荧光二抗在复染 后封片在荧光显微镜()下观察.统计学处理:使用 .统计软件分析实验数据统计资料以平均数标准差()表示满足正态分布时两组
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