磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用.pdf
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1、 第5 9卷2 0 2 3年第5期 西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)V o l.5 9 2 0 2 3 N o.5 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e)D O I:1 0.1 6 7 8 3/j.c n k i.n w n u z.2 0 2 3.0 5.0 1 3收稿日期:2 0 2 2 1 1 0 5;修改稿收到日期:2 0 2 3 0 2 1 0基金项目:兰州市城关区科技计划项目(2 0 1 9 R C C X 0 0 0
2、 7);兰州市科技计划项目(2 0 2 2-2-1 0 5);甘肃省科学院科技产业化项目(2 0 2 1 C Y-0 3);甘肃省科技专员专项(2 2 C X 8 G A 1 0 4);甘肃省科学院优秀青年基金项目(2 0 2 3 YQ-0 1)作者简介:刘一丹(1 9 9 0),女,甘肃兰州人,助理研究员,在职博士.主要研究方向为纳米材料及生物传感技术.E m a i l:l i u y i d a n 5 5 3 6 6 9 61 6 3.c o m磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用刘一丹,左显维,韩根亮,宋玉哲,王 焱(甘肃省科学院 传感技术研究所,甘肃省传感器与传感技术重点实验室,甘
3、肃 兰州 7 3 0 0 0 0)摘要:建立了一种基于磁性荧光免疫纳米探针的竞争性免疫分析法并用于检测人免疫球蛋白G(I g G),蛋白G被用作抗体与磁性纳米团簇定向结合的衔接蛋白.将蛋白质修饰的磁性纳米团簇与荧光猝灭剂(D A B C Y L)标记的山羊抗人I g G偶联,然后与羧基荧光素(F AM)标记的人I g G孵育,得到磁性荧光纳米复合免疫探针,最后与目标分析物(人I g G)孵育,进行竞争性免疫反应.结果表明,抗体的定向连接可以有效避免其抗原活性位点被包覆,而小尺寸的纳米团簇可以起到信号放大作用,从而提高检测灵敏度.该探针检测I g G的线性范围为0.0 61 4 6.0 0 n
4、m o lL-1,检测限为 0.0 2 n m o lL-1(S/N=3),其抗干扰能力强,并且能够用于人血清中I g G的检测.关键词:磁性荧光免疫探针;荧光共振能量转移;竞争免疫反应;人免疫球蛋白G中图分类号:O 4 8 2.5 4 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-9 8 8(2 0 2 3)0 5-0 0 7 5-0 8P r e p a r a t i o n a n d a p p l i c a t i o n o f t h e m a g n e t i cf l u o r e s c e n t i mm u n e n a n o p r o b eL I U
5、Y i-d a n,Z UO X i a n-w e i,HAN G e n-l i a n g,S ONG Y u-z h e,WANG Y a n(K e y L a b o r a t o r y o f S e n s o r a n d S e n s i n g T e c h n o l o g y o f G a n s u P r o v i n c e,I n s t i t u t e o f S e n s i n g T e c h n o l o g y,G a n s u A c a d e m y o f S c i e n c e s,L a n z h o
6、u 7 3 0 0 0 0,G a n s u,C h i n a)A b s t r a c t:I n t h i s w o r k,a c o m p e t i t i v e i mm u n o a s s a y b a s e d o n t h e m a g n e t i c f l u o r e s c e n t i mm u n e n a n o p r o b e w a s d e v e l o p e d f o r t h e d e t e c t i o n o f h u m a n i mm u n o g l o b u l i n G(I
7、 g G).P r o t e i n G w a s u s e d a s a n a d a p t o r p r o t e i n f o r d i r e c t i o n a l b i n d i n g o f a n t i b o d y t o m a g n e t i c n a n o c l u s t e r s.T h e n t h e m a g n e t i c n a n o c l u s t e r s m o d i f i e d w i t h p r o t e i n G w e r e c o n j u g a t e d
8、w i t h t h e f l u o r e s c e n c e q u e n c h e r(D A B C Y L)-l a b e l e d g o a t a n t i h u m a n I g G a n d i n c u b a t e d w i t h t h e c a r b o x y l f l u o r e s c e i n(F AM)-l a b e l e d h u m a n I g G t o o b t a i n t h e m a g n e t i c f l u o r e s c e n t n a n o c o m p
9、 o s i t e i mm u n o p r o b e,w h i c h w a s f u r t h e r i n c u b a t e d w i t h t h e t a r g e t a n a l y t e(h u m a n I g G)f o r c o m p e t i t i v e i mm u n o r e a c t i o n.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e d i r e c t i o n a l b i n d i n g o f a n t i b o d i e s c o
10、 u l d e f f e c t i v e l y a v o i d t h e c o a t i n g o f t h e a n t i g e n-a c t i v e s i t e.I n a d d i t i o n,t h e f l u o r e s c e n c e r e s p o n s e s i g n a l w a s a m p l i f i e d d u e t o t h e s m a l l s i z e o f t h e n a n o c l u s t e r s,t h u s i m p r o v i n g t
11、 h e d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y.B a s e d o n t h i s,a n e w f l u o r e s c e n t i mm u n e p r o b e w a s c o n s t r u c t e d f o r s e n s i t i v e d e t e c t i o n o f h u m a n I g G,w i t h a g o o d l i n e a r r e l a t i o n s h i p i n t h e c o n c e n t r a t i o n r
12、a n g o f 0.0 61 4 6.0 0 n m o lL-1.T h e l i m i t o f d e t e c t i o n w a s 0.0 2 n m o lL-1(S/N=3).M o r e o v e r,t h e p r e s e n t m e t h o d w a s s u c c e s s f u l l y a p p l i e d f o r t h e d e t e c t i o n o f I g G i n h u m a n s e r u m.K e y w o r d s:m a g n e t i c f l u o
13、r e s c e n t i mm u n e n a n o p r o b e;f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r;c o m p e t i t i v e i mm u n o a s s a y;h u m a n i mm u n o g l o b u l i n G57西 北 师 范 大 学 学 报(自然科学版)第5 9卷 J o u r n a l o f N o r t h w e s t N o r m a l U n i v e r s i t y(N a t u
14、r a l S c i e n c e)V o l.5 9 免疫球蛋白G(I g G)是人体血清中含量最高的抗体,它由免疫反应部分的B淋巴细胞产生,占血清中免疫球蛋白的7 0%8 0%,具有抗菌、抗病毒、抗毒素的特征,在机体免疫防护中起重要作用1-4.鉴于I g G是诊断慢性感染、慢性肝病、免疫性疾病的一个特异性临床指标,因此测定人血清中I g G的含量可对许多疾病的早期诊断提供依据.目前,检测 I g G 的主要方法为酶联免疫分析技术(E L I S A),然而标记酶需要特别的保存,且传统的E L I S A采用比色法检测,灵敏度和准确性有待进一步提高5.利用特定生物分子之间的特殊亲和 力
15、和 特 异 性,包 括 抗 体-抗 原、受 体-配 体D NA-蛋白质等的相互作用,已经开发出了一系列敏感和高选择性的生物检测探针6.而荧光免疫探针基于抗原抗体结合的免疫反应,将物质的荧光作为输出信号实现定量检测,体系兼具免疫反应的特异性和荧光响应的高灵敏度.在众多荧光检测体系中,荧光共振能量转移(F R E T)体系备受关注,它对供体和受体之间的分离距离极其敏感,其中发光供体通过非辐射偶极子-偶极子相互作用将能量转移到荧光或非荧光受体,当生物亲和反应使其接近时,就会在两个荧光团之间发生F R E T7-8.因而在单分子光谱9、蛋白质折叠1 0、细胞成像1 1和免疫分析1 2中有广泛的应用.纳
16、米材料具有独特的结构和性能,其与生物分子偶联构建的新型纳米探针,可极大地提高生物探针的性能.将生物分子偶联在具有生物相容性的纳米磁性材料表面,可以通过磁场将其从复杂基质中分离,从而减小背景信号,为生物分子的检测提供了简便的方法.磁性纳米材料已广泛应用于免疫分析1 3-1 4、酶固定化1 5等生化领域,如蛋白质的检测1 6、核酸杂交1 7和端粒酶活性检测1 8.然而磁性材料与I g G结合时普遍会面临一个问题,即磁性材料与I g G进行非特异性结合,使固定的抗体分子取向不一致,影响抗体的靶向效率.蛋白G是G型链球菌分离而得到的细胞壁蛋白,可以与I g G的补体端(F c端)以高亲和力特异性结合,
17、特别对人、兔和鼠的I g G表现出很高的亲和力1 9-2 0.由于蛋白G能够特异性识别I g G的F c端,因此,通过蛋白G的连接,可以将抗体分子定向固定在磁性材料上,使抗原结合部位(F a b)充分暴露,有利于分析物的结合,因此提高检测灵敏度,降低检出限.鉴于此,在聚丙烯酸(P AA)修饰的F e3O4磁性纳米团簇上连接蛋白G,从而在其表面定向固定抗体,并利用荧光团/淬灭剂对距离依赖性光学特性,设计分别标记荧光团和淬灭剂的抗原-抗体偶联复合物,制备出基于F R E T原理的磁性荧光纳米免疫探针,并利用此探针与目标物I g G的竞争性免疫反应,建立了灵敏、快速检测I g G的新方法.P AA中
18、的羧基可与蛋白G的氨基连接,提高连接效率和强度.将这种羧基化磁性纳米团簇与蛋白G的复合材料用于抗体的定向固定,抗体活性F a b部分充分暴露在外侧,极大地提高了抗体的结合效率.而小尺寸的纳米团簇可以起到信号放大作用,从而提高检测灵敏度.1 实验部分1.1 实验试剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(E D C)、2-吗啉乙磺酸(ME S)均为分析纯,购自美国 s i g m a-a l d r i c h公司;重组蛋白G(p r o t e i n G)、牛 血 清 蛋 白(B S A),纯 度9 8%,购 自 美 国 s i g m a-a l d r i c h公司;人免疫球蛋
19、白G(I g G)、4-4-(二甲基氨基)苯偶氮 苯甲酸标记羊抗人免疫球蛋白G(D A B C Y L-a n t i-I g G)、荧光素二乙酸酯标记人免疫球蛋白G(F AM-I g G)购自北京博奥森生物技术有限公司;灭菌去离子水.纳米团簇的洗涤和活化缓冲液为0.0 5 m o lL-1 ME S溶液(p H=6.0),培养免疫复合物的缓冲液为含0.1 m o lL-1 N a C l 的 0.0 1 m o lL-1 磷酸盐(P B S,p H=7.4).1.2 磁性荧光免疫纳米复合探针的制备利用D i s c o v e r S P型 单 模 微 波 合 成 仪(美 国C EM公司),
20、通过微波辅助多元醇法制备得到聚丙烯酸修饰的磁性纳米团簇(P AA-F e3O4N C s)2 1.取5 0 0 L 1 0 m gm L-1磁性纳米团簇分散液到离心管中进行磁分离,用0.0 5 m o lL-1 ME S(p H=6.0)缓冲液洗涤3次后,加入5 0 0 L 1 0 m gm L-1 E D C,室温孵育5 0 m i n,以活化羧基.在活化后的磁性纳米团簇中加入2 0 0 L 1 m gm L-1蛋白G,室温孵育3 h,磁分离弃去未连接的蛋白G,用ME S缓冲液洗涤后,重新分散在含1.0%B S A的P B S中,然后在室温下孵育2 h,以消除非特异性结合,磁分离除去多余的B
21、 S A.洗涤后加入5 0 0 L 0.1 6 m gm L-1荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G(D A B C Y L-a n t i-I g G),室温下孵育2 4 h,67 2 0 2 3年第5期 刘一丹等:磁性荧光免疫纳米探针的制备及检测应用 2 0 2 3 N o.5P r e p a r a t i o n a n d a p p l i c a t i o n o f t h e m a g n e t i c f l u o r e s c e n t i mm u n e n a n o p r o b e得到F e3O4N C s-p r o t e i n G-D A
22、B C Y L-a n t i-I g G.洗涤后再次分散在含1.0%B S A的P B S中,在室温下孵育2 h,以消除非特异性结合,并进行磁分离.最后用0.0 1 m o lL-1 P B S(p H=7.4)缓冲液洗涤3次,在4 下储存待用.吸取1 2 L 2.5 m gm L-1 F AM-I g G和4 8 8 L P B S,加 入 到F e3O4N C s-p r o t e i n G-D A B C Y L-a n t i-I g G的P B S溶液,混合均匀后,在3 7 下孵育1 h,得到磁性荧光免疫纳米复合 探针(F e3O4N C s-p r o t e i n G-D
23、 A B C Y L-a n t i-I g G-I g G-F AM).1.3 血清样品的制备随机留取门诊患者的血液样本,利用H 1 6 5 0型台式高速离心机(湖南湘仪)离心1 5 m i n(4 0 0 0 rm i n-1)获得血清,然后在-2 0 保存,进行分析前用0.0 1 m o lL-1 P B S(p H=7.4)缓冲液稀释.1.4 人免疫球蛋白G的检测采用F S 5型一体化稳态瞬态荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)测定荧光强度,激发和发射波长分别为4 9 0和5 1 7 n m.用荧光光谱仪检测磁性荧光免疫纳米复合探针的初始荧光强度.将过量的免疫复合探针分为8等份,分别加入不同浓
24、度梯度(0.0 6,1 2.0 0,4 5.6 0,7 0.7 0,1 1 0.0 0,1 4 6.0 0,1 8 0.0 0,2 1 0.0 0 n m o lL-1)的I g G标准液或样品液,在3 7 下孵育3 h,进行免疫竞争反应.随后将磁性荧光免疫纳米复合探针通过磁分离,测定上清液的荧光光谱.2 结果与讨论2.1 竞争性免疫反应的检测原理竞争性免疫反应的检测原理见图1.在羧基化的磁性纳米团簇(F e3O4N C s)表面修饰蛋白G,用于定向连接荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G(D A B C Y L-a n t i-I g G),制得荧光淬灭剂标记的羊抗人免疫球蛋白G修饰的F e3
25、O4磁性纳米团簇;将它与F AM荧光素染料标记的人I g G(F AM-I g G)混合后,磁性纳米团簇上的抗体与I g G特异性结合,F AM荧光团与荧光淬灭基团D A B C Y L靠近,发生荧光共振能量转移,F AM的荧光淬灭;当加入目标检测物I g G时,I g G与F AM-I g G竞争结合磁性纳米团簇上的抗体2 2,因此磁性纳米团簇上的F AM-I g G减少,发生F R E T的荧光强度减少,而磁分离后上清液荧光信号增强;随着I g G加入量的增多,竞争免疫反应持续发生,上清液中荧光信号不断增强,I g G与荧光信号响应成正比,从而定量检测I g G.图1 磁性荧光免疫纳米探针
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