紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞凋...3K_AKT信号通路的影响_赖瑞.pdf
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1、基金项目:湖北省陈孝平科技发展基金项目()三阴性乳腺癌病人术后应用槐耳颗粒的疗效及机制研究作者简介:赖瑞(.),女,硕士,住院医师,研究方向:中西医结合临床外科学,:.紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞凋亡及 信号通路的影响赖 瑞 史晓光 左禧萌 汪唐顺 刘洁丽 杨臻瑞 冯 雪 王玉坤 高 爽 孙 萍(北京中医药大学东直门医院,北京,)摘要 目的:探讨紫草素对乳腺恶性肿瘤 和 细胞凋亡以及 信号通路表达的影响。方法:将 及 细胞系用含不同浓度紫草素的完全培养基(分组为、.、.、.、.)进行培养,法检测细胞活性,染色后流式细胞仪检测细胞凋亡情况,蛋白质印迹法测定细胞内 表达情况。结果:与空白对照组()比较
2、,紫草素浓度为.以上时对乳腺癌 及 细胞生长具有显著抑制作用,最佳作用浓度为.;与空白对照组比较,及 细胞的凋亡水平随紫草素浓度增加而增加,且差异有统计学意义(.);与空白对照组比较,经紫草素处理的 及 细胞 表达均出现不同程度下降,差异有统计学意义(.)。结论:紫草素具有针对 及 乳腺癌细胞系的抗肿瘤作用,其机制可能与其抑制 信号通路有关。关键词 紫草素;乳腺恶性肿瘤;细胞凋亡;高转移恶性乳腺癌细胞系;原位雌激素受体阳性乳腺癌细胞系;磷脂酰肌醇 激酶 ,(,):()():(,.,.,.,.),:(),.,.(.),(.):;中图分类号:;文献标识码:目前乳腺恶性肿瘤的治疗日趋成熟,主要治疗包
3、括手术治疗、化学药物治疗、靶向药物治疗、内分泌药物治疗等,但上述治疗失效后的挽救措施仍不完善,免疫治疗及中医药治疗在个体化治疗中存在一定优势。紫草味甘、咸,性寒;归心、肝经;有凉血,活血,解毒透疹之功效,常用于治疗乳岩瘀毒互结之证,证见胸胁胀满,走窜疼痛,乳房包块,刺痛固定,胸闷,情志抑郁或易怒,善太息,脘腹胀满,面色晦暗。其主要成分紫草素具有广泛的药物活性,包括抗瘤作用、抗炎作用及条件免疫作用。研究表明,紫草素对多种恶性肿瘤细胞均有明显的抗肿瘤活性,能够抑制乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌等癌症的发生发展。本研究主要探讨紫草素对乳腺恶性肿瘤 及 细胞的促凋亡作用,为进一步发掘其作用机制提供研究
4、基础。材料与方法.材料.细胞三阴性乳腺癌 细胞购自北京协和医院细胞库,细胞购自武汉普诺赛生物公司。细胞系经短串联重复序列(,)鉴定且无支原体。,的加湿培养箱环境下培养传代。,.试剂 紫草素对照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批号:),用二甲亚砜充分溶解,制成终浓度为 的母液,.滤膜过滤 次,短期(周内)保存。胆囊收缩素(,)检测试剂盒(兰杰柯科技有限公司,批号:);凋亡检测试剂盒(兰杰柯科技有限公司,批号:);蛋白酶抑制剂 (北京索莱宝科技有限公司,批号:);细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司,批号:);磷脂酰肌醇 激酶(,)抗体(,美国,批号:);蛋白激酶(,)抗体(,);甘油醛磷酸脱氢 酶
5、(,)(,美国,批号:);山羊抗兔二抗()()(,美国,批号:);杜尔贝科改良伊格尔培养基(,)高糖溶液(兰杰柯科技有限公司,批号:);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,批号:);青霉素链霉素()溶液(兰杰柯科技有限公司,批号:)。.仪 器 手 持 式 超 声 波 细 胞 裂 解 仪(,德 国,型 号:);流 式 细 胞 仪(,美国,型号:);化学发光成像仪(上海天能科技有限公司,型号:);酶联免疫检测仪(,美国,型号:)。.方法.分组与模型制备.测细胞活性 孔板种植密度为 个的 细胞或 细胞。待细胞贴壁后,加入含不同浓度(、.、.、.)紫草素的培养基,并设置含.二甲基亚砜(,)培养基的
6、对照组。.蛋白质免疫印迹法 培养瓶中种植密度为.或 细胞 瓶。.凋亡检测六孔板种植密度为.或 细胞 孔。.干预方法.测细胞活性每组分别培养 、后,弃培养基,每孔中加入 及 全培养基,孵育 。.蛋白质免疫印迹法待细胞贴壁后加入含不同浓度(、.、.、.、.)紫草素的培养基 培养 。.凋亡检测贴壁后加入含不同浓度(、.、.、.、.)紫草素的培养基 培养 。.检测指标与方法.细胞计数试剂()法测定细胞活性 用酶标仪在 处测定吸光度(,)值。根据公式计算细胞活性:抑制率()(观察 组 值 阴 性 对 照 值)(对 照 组 值 阴性对照 值),孵育时间为横坐标,纵坐标为细胞活性,绘制抑制曲线图。.蛋白质免
7、疫印迹法检测 表达用磷酸盐缓冲液(,)洗涤 次,加入适量胰蛋白酶消化,收集细胞悬液,离心(转速为 ,离心半径 ),弃上清,使用预冷的 清洗 次,离心(转速为 ,离心半径 )后收集细胞沉淀,每组细胞沉淀加入含蛋白酶抑制剂 的 裂解液,在冰上裂解细胞,手持式超声仪超声 。裂解后离心(转速为 ,离心半径.)收集上清,二奎啉甲酸(,)法 蛋 白 定 量 后 将 蛋 白 浓 度 调 至.,加 ,沸水煮 。用 聚丙烯酰胺凝胶电泳(,),转膜(,),封闭 ,一抗(,)孵育过夜。洗涤缓冲液(,)洗涤后加入二抗()孵育,洗涤,配制 发光液与膜共同孵育 ,化学发光成像仪自动曝光,摄 片,分析量化条带灰度值,计算相
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