银杏小孢子母细胞响应秋水仙碱低频多倍化的细胞学和转录组分析.pdf
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1、Journal of NuclearAgricultural Sciences1497核农学报2 0 2 3,37(8):1497 150 6文章编号:10 0 0-8 551(2 0 2 3)0 8-1497-10银杏小孢子母细胞响应秋水仙碱低频多倍化的细胞学和转录组分析柯梦1邓厚银1郭文斌2李艳星?米跃骐1李云1孙宇涵1,(北京林业大学生物科学与技术学院/国家林业和草原局刺槐工程技术研究中心/林木育种与生态修复国家工程研究中心/林木、花卉遗传育种教育部重点实验室,北京100083;襄垣县森防检疫站,山西长治0 46 2 0 0)摘要:银杏(Ginkgo bilobaL.)三倍体具有很高的综
2、合价值,但秋水仙碱诱导银杏有性多倍化仍较为困难,2 n雄配子最高得率仅有7%。为初步探究秋水仙碱诱导银杏2 n雄配子的形成机制,本研究使用0.6%的秋水仙碱对进入减数分裂粗线期的银杏小孢子母细胞进行避光瓶浸没处理,对不同处理时间下小孢子囊细胞中的微管骨架、生理生化变化以及转录本进行对比分析。结果显示,秋水仙碱处理的银杏小孢子母细胞游离脯氨酸、丙二醛含量及过氧化物酶活性在处理48 h时较高,可溶性蛋白含量和超氧化物酶活性低于对照组。与对照组相比,处理至2 4h时,细胞微管蛋白开始减少,48 h呈弥散状,厚度变薄,荧光显微下几乎无微管蛋白显现。转录组分析共筛选到46 90 个差异表达基因,其中热激
3、基因HSP11在48 h高差异表达。另外,在48 h鉴定到的41个差异转录因子中,有2 3个转录因子显著上调表达,其中最大的三个家族是AP2/ERF、M YB-r e l a t e d 和NAC蛋白家族。上述结果表明,48 h是秋水仙碱诱导银杏小孢子母细胞加倍的关键时间点,HSP11基因、AP2/ERF、M YB-r e l a t e d 和NAC转录因子家族成员在此过程中均起着关键的调控作用。本研究结果为探索与调控秋水仙碱诱导银杏2 n雄配子形成有关的通路提供了参考依据,并为后续银杏有性多倍化分子机理研究奠定了理论基础。关键词:银杏;倍性育种;转录组;秋水仙碱;花粉母细胞D0I:10.1
4、1869/j.issn.1000-8551.2023.08.1497多倍化是指生物体中多套染色体在同一细胞核内稳定遗传,产生拥有3套或以上完整染色体组个体的过程,是植物进化的重要因素1。自然界中至少一半的被子植物都经历过多倍化事件2 ,而在裸子植物中,银杏的多倍化研究也一直是重点关注内容3。通过形成2 n配子参与受精的有性多倍化是自然界多倍体产生的主要途径4,但自然发生多倍体的频率并不高。人工诱导能极大提高多倍体得率,目前已有银灰杨(Populus canescens)5 杜仲(Eucommia ulmoides)6等多个树种通过诱导2 n配子成功获得多倍体植株。人工诱导多倍体的方法包括生物学
5、诱导、物理诱导和化学诱导3类,其中化学诱导类的秋水仙碱处理一直被认为是多倍体育种中最常用、最经济的手段。银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科(Ginkgoaceae)落叶乔木,是现存裸子植物门中最古老的子遗植物,我国重要的经济林树种,具有广泛的栽培价值。然而由于市场需求旺盛,目前已获得的银杏新品种资源仍然供不应求7 。研究表明,三倍体在生长速度、果实产量、抗逆性等方面发挥巨大作用8 因此培育银杏三倍体对于提高其综合利用价值、满足市场需求至关重要。秋水仙碱处理能够诱导银杏小孢子母细胞产生2 n雄配子,但2 n雄配子得率低,最高只能达到7%9,不足以用于银杏多倍体培育。然而,即使已有研
6、究初步推测此现象可能与银杏小孢子母细胞中的蛋白质有关10 ,但秋水仙碱诱导银杏2 n雄配子低得率的具体原因和分子调控模式仍有待明确。鉴于此,本研究利用免疫荧光染色技术,结合考马斯亮蓝G-250法、三酮显色法、四氮唑蓝法、愈创木酚法和硫代巴比妥酸法等细胞生理生化检测技术,从细胞骨架和生理生化角度出发,连续跟踪观察和分析收稿日期:2 0 2 2-10-2 8 接受日期:2 0 2 3-0 2-0 7基金项目:国家自然科学基金项目(3197 16 7 5),国家重点研发课题(2 0 2 1YFD2200302),中央高校基本科研业务费专项资金资助(PTYX202236)作者简介:柯梦,主要从事经济林
7、木良种繁育研究。E-mail:k e m e n g 12 16 16 3.c o m*通讯作者:孙宇涵,副教授,主要从事林木遗传育种研究。E-mail:s y h 8 310 0 8 16 3.c o m149837卷报核农学秋水仙碱诱导的银杏小孢子母细胞在各时间点的不同变化,最终经过筛选并确定可能影响银杏小孢子母细胞受秋水仙碱加倍诱导过程中的关键时期。然后通过转录组测序技术挖掘响应秋水仙碱诱导的相关基因,以期为解决秋水仙碱诱导银杏2 n雄配子低得率这一问题提供数据参考,同时为从分子水平探索秋水仙碱诱导生殖细胞加倍过程中的调控机制,从而进一步提高林木有性多倍化个体得率奠定理论基础1材料与方法
8、1.1试验材料以北京林业大学鹫峰林场(40.0 6 7 8 7 N,116.0 8 134E)的一株30 年生银杏为试验材料,初春时取带雄球花的枝条于温室中水培(2 0 30),观察其生殖细胞发育状况。当其小孢子母细胞即将进人减数分裂的粗线期时10),对雄球花进行0.6%秋水仙碱(colchicine)避光瓶浸法处理2 d(处理组,简称为CC)和蒸馏水处理2 d(对照组,简称为CK)1.2生理生化变化检测收集秋水仙碱和蒸馏水处理0、12、2 4、36、48、6 0、72、8 4、96 h 后的小孢子囊,-8 0 冷冻保存后用于生化指标测定,每项指标重复3次。其中,采用考马斯亮蓝G-250法测定
9、可溶性蛋白含量12 ,节三酮显色法测定游离脯氨酸(proline,PRO)含量13),四氮唑蓝法测定超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SO D)活性13,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde,M D A)含量13,愈创木酚法测定过氧化物酶(peroxidase,POD)活性13 1.3碳蜡切片定期随机摘取处理组和对照组发育良好的3 5个银杏花芽,用福尔马林-乙酸-乙醇(formalin-aceto-alcohol,FAA)固定液V(乙醇):V(甲醛):V(冰醋酸)=18:1:1固定6 0 min后,使用聚乙烯二醇(polyethleneglycol,P
10、EG)包埋银杏样本,切片观察141.4免疫荧光观察选取秋水仙碱和蒸馏水处理0、12、2 4、48 和96 h后的银杏小孢子囊,固定剂处理6 0 min,用双抗免疫荧光一抗:anti-tubulin(T-90 2 6,Si g ma 公司,美国),二抗:anti-mouse IgG FITC conjugated(F-0257,Sigma公司,美国)染色,在激光共聚焦扫描显微镜下观察小孢子微管蛋白的变化情况141.5RNA-seq测序及差异表达基因分析根据免疫荧光观察和生化检测结果,选择不同时间点(0、2 4、48、96 h)对照组和处理组的材料作为测序样本,3次生物学重复。首先利用Sequel
11、测序仪第三代(PacBio公司,美国对样本全长cDNA进行测序,将获得的全长转录本序列与已发表的银杏全基因组测序结果15 比对,并将三代转录组注释结果和原基因组结果进行合并,作为进行二代转录组检测差异表达基因分析的参考序列比对注释,然后利用二代高通量测序技术Illumina HiSeqT(Illumina公司,美国)对随机抽取的处理组和对照组各3份重复样本材料进行文库构建和测序分析,最后经过滤得到cleanreads比对到前期合并后所得参考序列,经过差异表达分析筛选出样品间差异表达基因,并利用基因本体富集分析(GeneOntology,G O)和京都基因和基因组百科全书富集分析(KyotoEn
12、cyclopedia ofGenes and Genomes,KEGG)对筛选的差异基因进行进一步的功能富集,从而确定其在秋水仙碱加倍诱导下所行使的主要生物学功能。1.6数据处理采用GraphPadPrism9.0进行数据统计和生理生化指标变化分析,并应用SPSS25.0软件的T检验进行统计学检验,统计的显著性水平为P0.05。2结果与分析2.1银杏小孢子母细胞生理生化变化差异以蒸馏水处理为对照,选择小孢子母细胞发育的0、0.5、1、3、6、12、2 4、36、48、6 0、7 2、8 4和96 h进行生理生化检测。结果发现,对照组和处理组的生化指标随时间增加均有不同程度的变化。与对照组相比,
13、除12h以外,48 h前处理组可溶性蛋白含量始终高于对照组,而48 h后,处理组可溶性蛋白含量呈下降趋势且低于对照组(图1-A)。相较于可溶性蛋白,对照组和处理组中游离脯氨酸含量变化趋势均保持一致,且处理组始终高于对照组,但在36 48 h对照组含量持续下降时,处理组游离脯氨酸含量开始出现缓慢上升,并在48 h下降(图1-B)。处理组的超氧化物歧化酶活性在0 12 h呈下降趋势,对照组则缓慢上升,延至12 h后,两种处理方式的超氧化物歧化酶活性均在极速上升(12 2 4h)后趋于平缓,且二者间差异较小(图1-C)。另外,对照组和处理组的过氧化物酶活性在0 48 h均表现为下降趋势,但处理间差异
14、较小,48 h后,处理组的过氧化物酶活性开始缓慢上升且始终高于变化不明显的对照组(图1-D)。秋水仙碱诱导的丙二醛含量在096h均比对照组高,且在6 12 h间,处理组的丙二醛1499银杏小孢子母细胞响应秋水仙碱低频多倍化的细胞学和转录组分析8期CKCCAB600300*550602250500200(-1.8)/450150400*水350100300502500012243648 6072849601224364860728496CD1400400*350200300000250*800200600150400*100eaod20050001224364860728496012243648
15、60728496E处理时间Time/h231898916151401224364860728496处理时间Time/h注:*、*和*分别代表在相同时间下,CK和CC之间在P0.05、P 0.0 1和P0.001水平差异显著。Note:*,*and*represent the significant difference between CK and CC at the same time at 0.05.0.01 and 0.001 level,respectively.图1银杏小孢子母细胞内不同生理生化指标随秋水仙碱处理时间的变化情况Fig.1Changes of different phy
16、siological and biochemical indexes in G.biloba microspore mother cellstreated with colchicine at different time含量整体呈增加趋势,并在36 48 h后呈稳定的上升趋势(图1-E)。上述结果表明,随时间增加,经秋水仙碱诱导的银杏小孢子母细胞生理生化指标表现出不同程度的差异,尤其在处理后12、2 4、48 和96 h差异较明显。2.2秋水仙碱对银杏小孢子母细胞微管骨架的影响2.2.1银杏小孢子母细胞微管骨架结构对秋水仙碱的响应用荧光显微镜分别观察处理组和对照组0、12、2 4、48 和9
17、6 h的小孢子母细胞。结果发现,与对照组相比,经秋水仙碱处理的小孢子母细胞微管结构在012h变化不明显(图2-A、B、F、G)但在2 4h,处理组微管结构开始出现减弱现象(图2-H),48 h 时,指示微管骨架的荧光强度减到最弱,甚至消失(图2-1),而对照组的微管结构在2 4 48 h无明显变化(图2-C、D)。值得注意的是,至96 h时,对照组中小孢子母细胞正常进行减数分裂,处理组的绿色荧光也在逐渐显像,但依旧呈弥散状分布在细胞核内(图2-E、G)。上述结果表明,48 h可能是秋水仙碱诱导银杏小孢子母细胞多倍化形成的关键时间点。2.2.2银杏小孢子母细胞微管蛋白分布和微管厚度差异通过对秋水
18、仙碱处理48 h的银杏小孢子母细胞微管进行高倍显微三维扫描发现,对照组银杏小孢子母细胞内的微管结构呈聚合状(图3-A),而处理组小孢子母细胞的微管结构则呈弥散状(图3-B)。分析其微管骨架厚度发现,48 h对照组微管结构完整,呈聚合状,由蓝到红,微管蛋白层次由少到多(图3-C),处理组则呈弥散状,微管骨架厚度较薄(图3-D)。上述结果表明,秋水仙碱处理银杏小孢子母细胞48 h时,其微管蛋白的分布和厚度均出现了明显变化,因此可以进一步推测48 h可能是秋水仙碱诱导银杏小孢子母细胞多倍化的关键节点。2.3转录组测序挖掘与银杏小孢子母细胞多倍化相关的差异基因选取秋水仙碱处理组和对照组0、2 4、48
19、 和96 h的小孢子母细胞进行转录组分析,相关性分析表明样品间相关性较好(图4)。转录组测序的Q30(质量值30)碱基百分比至少为8 8%,表明测序结果可靠,可用于后150037卷报核农学注:AE分别表示空白对照0、12、2 4、48、96 h。F J分别表示秋水仙碱诱导处理0、12、2 4、48、96 h。红色荧光表示细胞核内的染色质或染色体,绿色荧光表示微管蛋白。其中A、F标尺为10 0 m,B、G 标尺为2 5m,C、D、H 标尺为5m,E、I标尺为7.5m,J标尺为10 m。Note:A-E indicate the negative control at 0,12,24,48 and
20、 96 h,respectively.F-J indicate the treated group at 0,12,24,48 and 96 h,respectively.Red fluorescence means chromatin or chromosomes in the nucleus and green fluorescence represents microtubule.The scare bar of A,F was 100 m,B,Gwas25m,C,D,Hwas5m,E,Iwas7.5m,Jwas10m.图2 秋水仙碱处理银杏小孢子母细胞细胞骨架显微结构Fig.2Cyto
21、skeletal microstructure of G.biloba microspore mother cells treated with colchicine after different time3注:A、B分别代表对照组和处理组的微管结构;C、D 分别代表秋水仙碱处理组微管骨架厚度。Note:A,B represent the microtubule structure of the control and thetreatment group,respectively.C,D indicates thethickness of the microtubule skeleton,
22、respectively.图348 h银杏小孢子母细胞微管高倍显微扫描结果Fig.3 High magnification microscopy of microtubules aftercolchicine treatment of G.biloba microspore mother cells for 48 h续分析。另外,在GO、K EG G 等数据库中分别注释到的基因数目为16 8 0 7、110 6 3,注释率达56.36%。以矫正后的P值错误发现率(falsediscoveryrate,FDR)0.05,差异倍数(fold-change,FC)2为筛选条件,鉴定到46 90 个差
23、异表达基因(图5)。经统计分析发现:与0 h相比,蒸馏水处理银杏小孢子母细胞2 4、48和96 h后,差异表达基因的数量变化不明显;但相比之下,秋水仙碱诱导的差异表达基因个数在2 4、48和96 h分别增加了2 2.1%、8 3.9%、6 0.6%,且随着秋水仙碱处理时间延长,差异表达的基因数目也随之增多,96 h筛选到的差异表达基因数目(92 0 1)比2 4h1.00CK0-1CK0-20.80CK0-30.60CK24-1CK24-20.40CK24-3CC24-10.20CC24-20.00CC24-3CK48-1CK48-2CK48-3CC48-1CC48-2CC48-3CK96-1
24、CK96-2CK96-3CC96-1CC96-2CC96-34484888图4样品间皮尔逊相关性检验Fig.4Pearson correlation among different examples(5144)多了7 8.9%(图5-A)。分析同一时间发现,处理24h时,共筛选到了193个差异表达基因,其中上调基因135个,下调基因58 个;至48 h时,鉴定到上调基因684个,下调基因7 41个,共142 5个差异表达基因;到96h时,挖掘到的差异基因明显增多,共340 0 个,其中2165个上调基因,12 35个下调基因(图5-B)。通过Venn图分析发现,在2 4、48 和96 h存在2
25、 3个重叠差异表达基因(图5-C)。2.4差异表达基因功能注释将所筛选的差异表达基因注释到GO数据库中,并对不同时间的前2 0 个GO富集结果进行统计分析。结果显示,随着秋水仙碱处理时间延长,差异表达基因富集的数量明显增多(图6)。具体来看,秋水仙碱处1501银杏小孢子母细胞响应秋水仙碱低频多倍化的细胞学和转录组分析8期A10000上调下调总计9201800075756000573056365144421441194095413240003.48035653121266126852.023200015535981.4340CK24vsCK0CC24vs CK0CK48vsCK0CC48vsCK
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