养殖迁移对菲律宾蛤仔挥发性有机物质组成变化的影响.pdf
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1、 Marine Sciences/Vol.47,No.6/2023 79 养殖迁移对菲律宾蛤仔挥发性有机物质组成变化的影响 杨 玲1,郭 贺2,许智慧2,邵倩文3,冉照收2,周成旭1(1.宁波大学 食品与药学学院,浙江 宁波 315211;2.宁波大学 海洋学院,浙江 宁波 315211;3.宁波海洋研究院 浙江 宁波 315832)摘要:环境条件变化是造成贝类挥发性有机物质(VOCs)组成变化的主要原因。菲律宾蛤仔养殖生产中,常进行从开放式自然滩涂迁移至人工围塘养殖的活动。本文研究了这一过程前后菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)肌肉组织的 VOCs 组成特征、变化及
2、其与环境因子相关性。结果显示:基于固相微萃取和气质联用技术,共鉴定出 52 种 VOCs,分别属于醛、醇、酯、烃、呋喃、烷烃、烯、芳香烃、含硫和含氮化合物等。迁移前样本中,检出 41 种化合物,迁移至人工围塘养殖 20 d 后,检出 32 种。迁移造成了化合物种类数量降低、种类发生变化。醛、醇类的相对含量最高、迁移前后的变化尤为显著,呈现由醛高醇低的组成逆转为醇高醛低的特点。溶氧是影响 VOCs 组成变化及其醇、醛类差别的重要因子。饵料生物量、相对丰度和多样性与 VOCs 的组成具有显著相关性:自然滩涂微型真核生物多样性高但生物量和丰度相对低,人工围塘多样性低但生物量和丰度高,是 VOCs 组
3、成差异的关键影响因子。本研究建立了贝类 VOCs 与关键环境因子的直接联系,为进一步解析贝类品质的环境关系、优化和调控养殖环境等研究提供了参考。关键词:菲律宾蛤仔;挥发性有机物;环境因子;微型浮游生物;养殖迁移 中图分类号:S966 文献标识码:A 文章编号:1000-3096(2023)6-0079-12 DOI:10.11759/hykx20220224002 我国是水产养殖大国,南北海域都有不同适养水产品种及其适养水域。菲律宾蛤仔(Ruditapes Philip-pinarum)是典型的滩涂贝类,环境适应性强,在我国从南到北沿海滩涂中,均有广泛的分布1。在突破了菲律宾蛤仔人工育苗技术以
4、后,其人工养殖更是蓬勃发展,成为滩涂养殖贝类产量最高和养殖规模最大的品种2,是人们喜闻乐见的以鲜美风味著称的大宗海鲜品3。随着海水养殖科学和产业技术发展,菲律宾蛤仔的养殖方式也实现了从传统的区域化养殖,转向育苗、养成、育肥等区块化特征,并进一步在我国形成了南北方不同水域联动的产业特征。并且,除了在自然滩涂水域进行养殖以外,菲律宾蛤仔还在人工围塘中作为适养贝类进行增养殖或育肥。生物和非生物环境与贝类的生化物质组成和代谢密切相关,如其营养价值、风味物质特征等,都因生长和所处环境而不同4。挥发性有机物是贝类风味品质构建的重要组成部分。研究表明,不同微藻对双壳贝类肉质挥发性成分会产生影响5-6。不同微
5、藻的营养物质存在差异,因此贝类摄入不同种类的微藻后,会对贝类本身的代谢产生影响,从而在挥发性成分上也造成影响7。挥发性成分的产生与贝本身的代谢过程息息相关,很多醇类、含羰基的化合物由不饱和脂肪酸经某些脂氧化酶作用衍生而来8,而酮类化合物是由氨基酸的降解和不饱和脂肪酸的自动氧化所产生9。此外,贝类的生长环境也与贝类的代谢息息相关,例如,刘朋超等10研究发现,温度、盐度、溶解氧等是影响生物群落的主要因素,在分析了两个不同海域的牡蛎后发现,其脂肪酸、糖原、挥发性成分均具有显著差异,并且大部分氨基酸成分与硅藻、甲藻呈正相关,与微球藻属、微胞藻属、鞭毛藻类、共甲藻目等呈负相关。菲律宾蛤仔是典型的滤食性贝
6、类,通过滤食水体中的微型藻类、有机碎 收稿日期:2022-02-24;修回日期:2022-09-05 基金项目:国家重点研发计划专项课题(2018YFD0900702);国家贝类产业技术体系(CARS-49)Foundation:Special Fund for National Key Research and Development Project of China,No.2018YFD0900702;National Shellfish Industry Tech-nology System,No.CARS-49 作者简介:杨玲(1996),女,硕士研究生,研究方向为贝类海鲜品风味构建的
7、环境溯源,E-mail:;周成旭(1968),女,通信作者,研究员,研究方向为贝类饵料营养与微藻资源利用,E-mail: 80 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 屑、细菌、原生生物等颗粒有机物为生。在贝类的人工围塘养殖中,也通过调节水质、藻相,不仅提高贝类食物来源、促进生长或育肥,其不同的藻相,也构造了养殖水产品不同的代谢过程,在风味特征上可能造成差异。“风味物质”是指一类能为人体感觉器官所感知的水溶性或挥发性的低分子量化合物。前者一般称为呈味物质,如氨基酸、核苷酸、肽,种类相对固定,可刺激人味蕾细胞产生酸、甜、苦、咸、鲜等感觉,目前对其研究较为透彻;而后者又可称为香气物质,通
8、常属于挥发性有机物质(VOCs),需在一定条件下,如加热、酶催化等,由风味前体物质转化而来,例如萜烯化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物11。对于贝类风味物质的研究较多地集中于不同区域之间的对比或不同储藏保鲜方式,而对于养殖迁移形成的生物和非生物环境综合影响下,养殖贝类的风味构建特征及相关机制的研究尚缺乏。本研究以解析贝类风味物质组成和特征构成与养殖区域变化的生物和非生物环境因子的综合关联性为目标,利用典型的养殖活动,即菲律宾蛤仔增养殖过程中的不同水域迁移,聚焦贝类挥发性物质的组成变化,研究其构建风味物质的组成及其与环境中微型浮游生物因子(饵料)和非生物环境因子之间的相关性,一方面深化养殖生物的
9、生理生态研究,另一方面,也为典型养殖方式影响下贝类海鲜品质优化以及养殖环境的人工调控提供参考。1 材料与方法材料与方法 1.1 野外采样、养殖迁移及养殖环境因子调查野外采样、养殖迁移及养殖环境因子调查 养殖迁移前菲律宾蛤仔(LA 组):采自福建省连江县定海湾开放式自然滩涂养殖区,采样点经纬度E1196730.09,N262357.04。鲜重为 20.6 1.7 g,平均体长 26.2 4.4 mm。取现场采样的部分样品于20 冷藏待测(LA 组)。活贝低温冷链转移自浙江宁波横码海水养殖围塘(E 1214628.53,N 293902.45),于围塘水质环境中养殖 20 d 后,第二次取菲律宾蛤
10、仔样品(HM组),于20 冷藏待测备用。迁移养殖前后非生物环境因子检测:两处采样点水质参数以多参数水质仪(EXO2,YSI,美国)测量,检测的环境参数包括水温、盐度、pH、溶解氧、总溶解固体、电导率和浊度。同时,以 BBE 荧光探测器(Moldaenke GmbH,德国)检测水体中叶绿素 a(Chl a)和蓝绿藻(BGA)的总体水平。采样地微型真核浮游生物群落调查:利用 18s高通量测序分析研究手段,对两处水体中微型真核浮游生物群落和差异特征进行了样品采集和分析。在两处采样水域,使用1 L采水器于水层中下部采集水样。现场用 200 m 筛绢对水样进行过滤,以去除大型浮游动物等生物以后,以 0.
11、45 m 滤膜过滤 1 L水样,滤膜存储于80 冰箱备用。采样各 3 次重复。开放式自然滩涂水样(LA)为贝类采样点被潮水淹没后在同一经纬度处的水样;围塘水样为同一围塘采水水样(HM)。利用核酸序列(18S)高通量测序和分析方法,对滤膜上微型真核浮游生物的组成结构进行分析。使用 Power Soil DNA 试剂盒(MO BIO Laborato-ries,Carlsbad,CA,USA)提取 DNA。使用连接有barcode的特殊引物扩增18S V4高变区,引物序列为:528F(5-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3)和 706R(5-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3)。
12、PCR 反应体系:15 L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs,3 L 引物,10 L 模板 DNA,2 L 无菌水。反应条件:98 预变性1 min,30个循环内98 变性 10 s,50 退火 30 s,72 延伸 30 s,最终 72 延伸 5 min。PCR 产物检测合格及回收纯化后,使用 NEB Next Ultra DNA Library Prep 试剂盒(New England Biolabs)构建文库,在 Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)上检测文库,合格
13、后通过 Ion S5TM XL 平台对文库进行高通量测序(北京诺禾致源科技股份有限公司)。使用 Cutadapt 对原始 reads 进行过滤,去除嵌合体序列后获得有效 reads。基于有效 reads进行 OTU(操作分类单元)聚类和物种注释分析,使用 Uparse 软件对序列进行分析,相似性97%的序列作为同一个OTU。基于 RDP Classifier 分类算法,与 Silva 128 数据库比对并结合 NCBI 更新序列进行物种注释,去除结果为Unclassified和Metazoa的序列,使用最少序列样本的序列数作为标准对样本进行抽平处理,最终得到均一化数据,形成分析使用的 OTU
14、表。1.2 菲律宾蛤仔挥发性风味物质分析菲律宾蛤仔挥发性风味物质分析 1.2.1 样品前处理样品前处理 将冷冻菲律宾蛤仔样品置于冰面上维持低温,稍解冻以后,取肌肉样品置于 50 mL 离心管内,各样品湿重为 1718 g。配置饱和食盐水,按照贝肉与食盐水 11 的比例,将食盐水倒入离心管中,增加 Marine Sciences/Vol.47,No.6/2023 81 挥发性成分的盐析效应以提高挥发性成分的提取效果12。使用 T25 高速分散机(德国 IKA 公司)进行匀浆处理后,取 5 mL 匀浆,倒入 15 mL 顶空进样瓶中,进行挥发性物质采样。两处采样点的样品各 5 个平行处理。1.2.
15、2 顶空固相微萃取和气相色谱顶空固相微萃取和气相色谱-质谱条件质谱条件 顶空固相微萃取条件:利用全自动固相微萃取进样系统(德国 Gerstel 公司)。样品首先在 60 下振荡平衡 15 min,再将预先老化 30 min 的 50/30 m DVB/CAR/PDMS 萃取头(美国 Supelco 公司)深入到样品顶空处吸附 20 min。此过程中,温度仍为 60 并持续振荡。吸附完成后,将萃取头插入到 GC 进样口,在 210 温度下解吸 7 min。色谱条件:利用 7890B-7000C 气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司),使用 VOCOL 毛细管柱(60 m0.32 mm1.
16、8 mm,德国 CNW 公司)进行分析。进样采用不分流模式,柱温箱起始温度35,保持 2 min,以 15/min,升温至 125,保持 1 min,再以 2/min 升温至 200,保持 12 min。载气为高纯氦气,流速为 1.6 mL/min;进样口温度210。质谱条件:EI 离子源;电子能量 70 eV;灯丝发射电流为 200 A,离子源温度为 230;扫描质量范围,50500 m/z。将测得的各化合物谱图与计算机谱库(NIST/Wiley)中的标准物质谱图进行对比,辅以人工图谱解析,并结合正构烷烃标准品的保留时间进行定性分析。按面积归一化法进行定性定量分析,求得各化合物的相对百分含量
17、。1.3 数据处理数据处理 采用 Simca 软件对各组挥发性风味物质的数据进行主成分分析(PCA);用 Excel 绘制百分比堆积图分析挥发性物质含量变化;微型真核浮游生物群落的 Alpha 多样性分析使用 QIIME 进行,Beta 多样性分析、组间差异、物种与环境因子的相关性均使用 R软件(vegan package)进行分析和可视化。2 结果结果 2.1 不同养殖区的水质、叶绿素不同养殖区的水质、叶绿素 a 及蓝绿藻生物量及蓝绿藻生物量 利用多参水质仪以及 BBE 荧光探测器,对两个养殖水域的水质及叶绿素 a 和蓝绿藻生物量进行了测定,结果如表 1 所示。表 1 开放式滩涂区(LA)和
18、围塘区(HM)水质及叶绿素 a 和蓝绿藻生物量 Tab.1 Water quality,Chla,and blue-green algae content at the two sampling sites(natural tidal flat,LA;enclosed aquaculture pond,HM)采样点 水温 T/盐度 S pH 溶氧 DO/(mgL1)总溶解固体TDS/(gL1)蓝绿藻 BGA-PE/(gL1)叶绿素 a /(gL1)28.409 26.25 7.83 5.61 26.74 11.01 3.27 28.388 26.08 7.85 5.68 26.59 11.47
19、 3.08 LA 28.382 25.74 7.83 5.96 26.27 8.67 2.46 25.67 15.24 7.75 7.19 16.29 166.66 59.73 25.669 15.24 7.83 7.19 16.29 167.58 59.24 HM 25.669 15.24 7.79 7.19 16.3 167.24 58.89 从调查的结果可以看出,非生物环境因子方面,开放式滩涂区水温和盐度均较围塘区高,pH 水平相近,溶氧水平在开放式滩涂区较围塘区较低。总溶解固体在开放式滩涂区显著高于围塘区,说明其水质的矿化程度高于围塘区。微藻生物因子方面可以看出,围塘区水中的藻类总体水
20、平远大于开放式滩涂区,其中藻类生物量(Chl a 含量)是开放式滩涂区的 20 倍,蓝绿藻水平是开放式滩涂区的 16 倍。因此,围塘区的养殖贝类处于食物生物量相对丰富的水域中。2.2 不同养殖区的微型真核浮游生物组成结构特征不同养殖区的微型真核浮游生物组成结构特征 本研究利用 18S 高通量测序和分析技术,重点比较了两个养殖区真核微型浮游生物的群落组成和结构特征及其差异性。开放式滩涂区,基于连江的三个样本 LA1、LA2、LA3 的有效数据进行分析,18S 文库经聚类得到1 474 个 OTU,分别隶属于 32 个门,295 个属,丰度最高的前十个门分别是 Diatomea、Ciliophor
21、a、Dinoflagellata、Protalveolata、Cryptophyta、Cercozoa、Chlorophyta、Ochrophyta、unidentified_Eukaryota、Chytridiomycota。82 海洋科学/2023 年/第 47 卷/第 6 期 丰度最高的前十个属分别是 Thalassiosira(Diatomea)、Chaetoceros(Diatomea)、Parastrombidinopsis(Ciliophora)、Karlodinium(Dinoflagellata)、Skeletonema(Diatomea)、Amoebophrya(Prota
22、lveolata)、Gyrodinium(Dinoflagellata)、Duboscquella(Protalveolata)、Pseudo-nitzschia(Diatomea)、Cryptocaryon(Ciliophora)。围塘养殖区,基于横码的 HM1、HM2、HM3 的有效数据进行分析,18S 文库经聚类得到 138 个 OTU,分别隶属于 24 个门,79 个属,丰度最高的前 6 个门分别是 Ciliophora、Cercozoa、unclassified Eukaryota、Dinoflagellata、Ochrophyta、Stramenopiles。丰度最高的前 6 个属
23、分别是 Didinium(Ciliophora)、Tintinnidium(Ciliophora)、Cercozoa、unclassified Eukaryota、Gyrodinium(Dinoflagellata)、Paraphysomonas(Ochrophyta)。可见,围塘水域的微型真核浮游生物物种类数显著低于开放式滩涂水域。图 1 为两组样本分别在门和属水平上的相对丰度图。从图中可以看出,开放式滩涂养殖区中,硅藻门(Diatomea)相对丰度最高,约占 47%,其次为甲藻门(Dinoflagellata)和纤毛虫门(Ciliophora),两者占比都近 16%。而围塘养殖区,纤毛虫门
24、(Ciliophora)占有相对最高丰度(约 67%),其次为丝足虫类(Cercozoa),占 14%,围塘中,甲藻和杂色藻(Ochrophyta)占比分别为 6%和 3%。图 1 基于 18S 核酸序列检测的微型真核浮游生物物种相对丰度(A 为门水平,B 为属水平)Fig.1 Relative abundance of microeukaryotic plankton operational taxonomic units based on 18S nucleic acid sequencing(A:phylum,B:genus)对两个水域微型真核浮游生物群落结构的 alpha 多样性分析结
25、果显示(表 2),围塘区(HM)样本的 Goods coverage 指数略高于开放式滩涂区(LA),说明其测序深度相对高。从分析群落多样性均匀度和稳定性等相关的几种指数来看,Shannon、Simpson、Chao1、ACE、PD 等各指数的值,在开放式滩涂区均大于围塘区。因此,结果显示了开放式滩涂区较围塘水域具有更高的群落多样性,物种分布更均匀,群落内物种的亲缘关系更为复杂。表 2 开放式滩涂区和围塘区的微型真核浮游生物群落的 alpha 多样性指数 Tab.2 Alpha diversity indices of the microeukaryotic plankton communit
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