DNA甲基化对水稻花药培养过程中黄化的影响.pdf
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1、14.生命科学版),2023,44(4):凯,孙引文格式:王尚,等。DNA甲基化对水稻花药培养过程中黄化的影响J.扬州大学学报(农业与笑,刘Jul.2023Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2023年7 月Vol.44No.4扬州大学学报(生命科学版)第44卷第4期DOI:10.16872/ki.1671-4652.2023.04.001DNA甲基化对水稻花药培养过程中黄化的影响王笑,刘凯,孙尚,薛超,龚志云1*(扬州大学农学院/江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室/植物功能基因组学教育部
2、重点实验室江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心,江苏扬州2 2 50 0 9)摘要:花药培养是一种常见的植物组织培养技术,其培养过程中易产生黄化苗,从DNA甲基化的角度探究水稻花药培养中幼苗高频黄化的机制。结果表明:水稻花药培养产生的黄化苗叶绿素含量降低,叶绿体形态异常。黄化苗基因组DNA甲基化水平明显升高。进一步分析发现绿苗和黄化苗差异甲基化基因主要富集在光合作用相关的途径。通过转录组分析发现,LOC_Os04g58200(O s PO RA)、LO CO s 0 1g 0 12 8 0(O s T LP2 7)、LO CO s 0 6 g 0 18 50(O
3、 s LFNR1)、LOCOs11g01140(O s NPH l a)、LO CO s 0 2 g 156 40(O s PYL3),LO C_O s 12 g 0 8 8 30、LO C_O s 0 7 g 0 536 0 0、LO CO s 0 6 g 40 6 40(O s A l d-Y)和LOC.Os07g01769个与光合作用相关的基因表达量发生改变,且甲基化水平也发生变化。综上,水稻花药培养过程中由于DNA甲基化而抑制光合作用中相关基因的表达,从而导致黄化苗的产生。关键词:水稻;花药培养;黄化苗;光合作用;DNA甲基化中图分类号:S511,Q 9 43.1文献标志码:A文章编号
4、:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 0 1-0 14Impacts of DNA methylation on etiolation in rice anther cultureWANG Xiao,LIU Kai,SUN Shang,XUE Chao,GONG Zhiyun(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding/Key Laboratory of PlantFunctional Genomics of the Ministry of Education/Jiangsu Key Lab
5、oratory of Crop Geneticsand Physiology/Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production of Grain Crops/College of Agriculture,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:Anther cultivation is a common plant tissue culture technique with great significance in rice breeding.How-ever,many etio
6、lated seedlings are easy to produce during the anther cultivation,and the reasons for their formation havenot been reported.In this study,the mechanism of high-frequency etiolated seedlings in rice anther cultivation was ana-lyzed from the perspective of DNA methylation.The results showed that the c
7、hlorophyll content of etiolated seedlingsproduced by rice anther cultivation was reduced,and the chloroplast morphology was abnormal.The level of DNA methy-lation in the genome of etiolated seedlings was significantly increased.Further analysis found that the differential methyla-tion genes of green
8、 seedlings and etiolated seedlings were mainly enriched in photosynthesis-related pathways.The expres-sion levels and methylation levels of the following genes had undergone correlation changes,such as LOC Os04g58200(OsPORA),LO C,O s 0 1g 0 12 8 0(O s T LP2 7),LO C O s 0 6 g 0 18 50(O s LFNR1),LO C
9、O s 11g 0 1140 (O s NPH l a),LO COs02g15640(OsPYL3),LOC,Os12g08830,LOC Os07g053600,LOC_ Os06g40640(OsAldY)and LOC_Os07g01760,which were associated with photosynthesis.It is shown that DNA methylation inhibits the expression of relevant genes inphotosynthesis during rice anther cultivation,resulting
10、in the production of etiolated seedlings.KEY WORDS:rice;anther culture;etiolated seedlings;photosynthesis;DNA methylation花药培养是常用的植物组织培养技术之一,能产生具有特定亲本特性的单倍体,然后通过自然或人工加倍获得纯合子二倍体,大大加快育种速度,因而广泛应用于培育各种水稻栽培品种1。但水稻花药收稿日期:2 0 2 2-11-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(318 7 12 32)作者简介:王笑(19 9 5一),女,江苏镇江人,扬州大学硕士研究生,主要从事水稻遗传
11、育种研究。*通信作者,龚志云,扬州大学教授、博导,主要从事水稻遗传育种研究;E-mail:z y g o n g?y z u.e d u.c n。2扬州大学学报(农业与生命科学版)第44卷培养中常产生大量黄化苗,有时高达8 0%9 0%2 。这已成为花药培养在水稻育种中进一步发展和应用的重大障碍之一。基因突变曾被认为是导致幼苗黄化的主要原因,但其发生频率如此之高并不符合基因突变的规律。因此,急需对水稻花药培养中高频黄化的分子和遗传调控机制进行深入研究3愈伤组织的诱导和分化是水稻花药培养的2 个重要过程。脱分化及营养、光温不足等不利因素均可能阻碍愈伤组织的形成。这些因素会刺激表观遗传调控的变化,
12、因此黄化苗的出现可能与表观遗传调控有关4。尽管水稻基因组已完全测序,但关于水稻花药培养表观遗传学的相关报道却很少5-6 。在植物生长过程中,重金属、干旱、盐、高温等诸多不利因素经常阻碍植株的正常生长。生物通常进化出相应的调节机制(基因转录、翻译调控或表观遗传学)来抵御这些不利因素7-8 。DNA甲基化是一种不改变DNA序列的保守表观遗传学机制,由DNA甲基转移酶催化基因组CpG二核苷酸中胞嘧啶第5碳位的甲基发生共价结合反应而产生,通过改变染色质结构、DNA构象和DNA稳定性导致基因表达水平的改变 ,在植物基因组稳定性、环境响应和发育调控中具有重要意义10 。以往研究 表明,水稻在组织培养或再生
13、过程中易获得或失去DNA甲基化,影响其正常生长发育。本研究通过亚硫酸盐测序(BS-Seq)和RNA测序(RNA-Seq)技术,分别对水稻花药培养中产生的绿苗和黄化苗进行转录组和甲基化组分析,确定它们之间的差异性;利用SPAD叶绿素仪和分光光度计检测黄化苗叶绿素含量,利用透射电镜成像技术观察叶绿体形态的变化;通过对绿苗和黄化苗的差异DNA甲基化基因以及转录组水平中差异表达基因的分析,探究花药培养过程中高频黄化苗的产生可能与DNA甲基化的影响机制。1材料与方法1.1试验材料供试品种为梗稻品种日本晴。用湿润的纱布包裹水稻幼穗,放人4冰箱预处理7 d。经消毒、冲洗等处理后,将合适的颖花花药均匀地撒在花
14、药培养基表面,置于(2 5士1)的暗环境中培养,培养34周后开始观察花药对诱导的反应。然后将愈伤组织转移到再生培养基上,在(2 5土1)的人工光照下培养。最后将再生的绿苗和黄化苗转移到生根培养基中形成根系。1.2光合色素含量的测定取生长14d的绿苗和黄化苗用于光合色素含量的测定。利用SPAD-502型叶绿素仪(日本柯尼卡美能达公司)测定叶片上、中、下部的透光系数,重复3次,计算平均SPAD值。利用紫外/可见分光光度计(Lambda650型,美国铂金埃尔默公司)测定5张叶片不同部位的色素含量。1.3叶绿体透射电镜观察采集生长14d的绿苗和黄化苗叶片,切成约1mm1mm的小片。样品用2 5%戊二醛
15、磷酸盐缓冲液(pH7.4)在4下预处理4h,用0.1mol1-1PBS清洗3次,每次15min。接着用钱酸固定4h,再用0.1mol1-1PBS清洗3次,每次15min。然后用梯度乙醇(分别为50%、7 0%、8 0%、9 0%、95%、10 0%)溶液、10 0%丙醇和10 0%丙酮与无水NazS04逐级脱水。丙醇与树脂1:1混合浸泡1h,丙酮与树脂1:2 浸泡2 h,纯树脂浸泡2 h。用LRWhite树脂浸渍,6 0 聚合2 d。用LeciaEMuc6超显微切片仪(德国徕卡公司)制备超薄切片,超薄切片染色正常,并用TecnaiSpirit(12 0 k V)透射电镜(荷兰飞利浦公司)观察叶
16、绿体结构。1.4DNA提取和BS-seq文库构建使用DNeasyPlantMini(Q i a g e n 6 9 10 4,德国凯杰公司)从绿苗和黄化苗的叶片中提取总基因组DNA(g D NA)。使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪评估基因组DNA质量,使用Bioruptor(比利时Diagenode公司)将gDNA切成10 0 50 0 bp的片段。在末端修复、腺苷酸化和接头序列连接(以防止亚硫酸盐转化)后,以ZYMO甲基化试剂盒(美国ZYMOResearch公司)用亚硫酸氢盐处理DNA片段。处理后DNA在自旋柱上纯化,用于制备测序文库。在这一过程中,亚硫酸盐处理的单链DNA随机引物使用聚合
17、酶能读取尿嘧啶核苷酸合成含特定序列标签的DNA。然后用这些标签通过PCR在原土笑等:DNA甲基化对水稻花药培养过程中黄化的影响第4期始DNA链的5 和3 端添加接头序列。表观基因组库被稀释并加载到cBotDNA集群生成系统。聚类生成完成后,将2 个样本转移到IlluminaHiSeq2000平台(北京诺禾致源公司)进行测序。所有步骤均按照制造商的说明进行。1.5BS-Seqq数据分析首先对Illumina测序获得的原始数据进行处理,过滤掉含有接头序列、未知或低质量碱基的reads,然后用比对软件Bowtie2(h t t p:/b o w t i e b i o.s o u r c e f o
18、 r g e.n e t/b o w t i e 2/i n d e x.s h t m l)将唯一的净reads映射到水稻参考基因组(https:/phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#info?a l i a s=O r g O s a t i v a)。基因组元素的鉴定采用Li等12 方法进行。利用BS-Seq数据检测单个碱基的甲基化状态、甲基化胞嘧啶位点的数量以及每个基因组原色的甲基化比例。甲基化水平(%)由每个甲基化胞嘧啶(C)的读数除以胞嘧啶的总读数得到。差异甲基化区域(DMRs)包含至少5个CG(CH H 或CHG)位点,甲基化水平发生2 倍变
19、化(Fisher精确检验,P0.05)。在多次试验中,采用错误发现率(FDR)方法确定P值的阅值。使用R包进行基础数据操作和统计分析。当1个基因上至少有1个DMR时,该基因被认为是差异甲基化基因(DMG)。使用Blast2GO软件获取每个DMG的GO信息,利用WEGO网站(http:/w e g o.g e n o mi c s.o r g.c n/)上传每个DMG的注释信息,并根据功能对DMGs进行分类。功能意义的GO富集分析应用超几何测试将所有DMGs映射到GO数据库中,在与全基因组相比的差异甲基化基因中搜索显著富集的 GO术语13与全基因组背景相比,KEGG通路富集分析可确定DMGs中显
20、著富集的代谢通路或信号转导通路。计算公式和应用程序与GO分析相同。随后,以FDR(q 值)0.0 5作为值来确定DMGs中最显著富集的通路。使用MapMan软件(http:/mapman.gabipb.org)描述与DMGs相关的生物途径14。为提供高或低DMGs的描述,使用Cluster软件和JAVATreeView软件进行聚类分析。将一份包含2 个样本中DMGs及其甲基化比例的文件上传到GeneCluster3.0。经过数据过滤和日志转换后,采用平均连锁法对基因和阵列进行分层聚类。利用Cluster软件生成的格式文件结合JAVATreeView软件,可直观地观察图形化显示的聚类结果。1.6
21、RNA提取和转录组测序使用TaKaRaRNAisoPlus(总RNA提取试剂,日本TaKaRa公司),参照试剂盒的标准操作程序,从用于甲基组分析的同一绿苗和黄化苗中分离总RNA。使用NanoDropND-2000分光光度计(美国赛默飞世尔公司)和Agilent生物分析仪(2 10 0,美国安捷伦公司)检测RNA浓度和质量。使用RNACleanXPKit(C a t#A 6 39 8 7,美国见克曼库尔特公司)和RNase-FreeDNaseSet(C a t#7 9 2 54,德国凯杰公司)纯化总RNA。每个样品使用5gRNA进行文库构建。文库测序由上海伯豪生物公司完成。利用Illumina-
22、HiSeq2000/2500、M i Se q、Ne x t G e n e r a t i o n Se q u e n c i n g(NG S)技术对绿苗和黄化苗的cDNA进行测序。移除接头序列和低质量reads,执行端测序。使用HISAT和Bowtie2工具将净reads比对到水稻基因组注释项目(http:/r i c e.p l a n t b i o l o g y.m s u.e d u/)。基因表达分析使用RESM软件计算FPKM值。差异表达基因(DEGs)采用NOISeq软件进行筛选,筛选标准为fold change2且P0.05。利用GO和KEGG工具对DEGs进行分析。1
23、.7RNA提取和RT-qPCR分析基因表达用TaKaRaRNAisoPlus(总RNA提取试剂)从生长14d的绿苗和黄化苗幼叶中提取和纯化总RNA。用TaKaRaPrimeScriptTMRTReagentKit合成第1链cDNA,用不含RNase的ddH,O稀释反转录产物。RT-qPCR分析使用TaKaRa SYBRPremisExTaqII(Pe r f e c t Re a l T i m e)试剂盒和ABI7300实时定量PCR系统(美国AppliedBiosystems公司)。泛素蛋白UBQ引物的UBQ-1作为内参基因。采用循环阈值(Ct)2-A A Ci 方法计算每个样本中所选基因
24、的相对表达量。进行3次独立的生物学重第44卷扬州大学学报(农业与生命科学版)复。用于RT-qPCR的基因特异性引物见表1。1.8DNA提取与重亚硫酸盐测序从生长14d的绿苗和黄化苗幼叶中提取7 50 ng的DNA,抽提的DNA用ZYMO甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐处理。使用Free Bisulfite Primer Design Tool(https:/ Hot Start(日本TaKaRa公司)从处理过的DNA中扩增目标片段。扩增产物使用Axygen凝胶提取试剂盒(美国Axygen公司)纯化,所有片段连接到pMDTM18T载体(日本TaKaRa公司)中,挑选至少6 个独立的单克隆由尚亚(杭州)
25、生物技术公司测序。然后使用Kis-meth(http:/katahdin.mssm.edu/Kismeth)进行甲基化分析15。所用引物见表1。2结果与分析2.1水稻花药培养中黄化苗的形成表1RT-qPCR和重亚硫酸盐测序试验使用的引物Tab.1Primers used in RT-qPCR experiments and Bisulfite-PCR analysis引物名称引物序列(5-3)扩增方法primer nameprimer.sequencings(5-3)amplificationmethodUbq-F-RTAACCAGCTGAGGCCCAAGART-qPCRUbq-R-RTACG
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