OsGA3ox通过合成不同活性GA调控水稻育性及株高.pdf
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1、Hereditas(Beijing)2023 年 9 月,45(9):845855 收稿日期:20230315;修回日期:20230614;网络发布日期:20230719 基金项目:国家自然科学基金面上项目(编号:32071930),湖南省自然科学基金面上项目(编号:2022JJ30421,2021JJ30445)和长沙市自然科学基金项目(编号:kq2014076)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.32071930),the Hunan Province Natural Science Foun
2、dation Project(Nos.2022JJ30421,2021JJ30445)and the Changsha City Natural Science Foundation Project(No.kq2014076)作者简介:郝小花,博士,副教授,研究方向:植物生理与分子生物学。E-mail: 通讯作者:李东屏,博士,教授,研究方向:植物生理与分子生物学。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-058 研究报告OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 郝小花1,2,胡爽2,赵丹2,田连福2,谢子靖2,吴莎2,胡文俐2,雷晗2,李东屏2 1.湖南
3、文理学院生命与环境科学学院,植物产品精深加工科技创新团队,常德 415000 2.湖南师范大学生命科学学院,长沙 410081 摘要:赤霉素(gibberellin,GA)是一种重要的激素,参与调控植物多种生长发育过程。GA 生物合成通路已基本阐明,其中赤霉素 3 羟化酶(gibberellin 3-hydroxylase,GA3ox)是多种活性 GA 合成的关键酶。水稻中有 2个 GA3ox 基因(OsGA3ox1 和 OsGA3ox2),其生理功能虽有初步研究,但它们在合成活性 GA 调控水稻发育过程中是如何分工协作尚不清楚。本研究通过 CRISPR/Cas9 技术获得基因编辑突变体 ga
4、3ox1 和 ga3ox2,发现 ga3ox1花粉育性显著下降,而 ga3ox2 株高显著变矮,表明 OsGA3ox1 是花粉正常发育必需的,而 OsGA3ox2 是茎叶伸长必需的。组织表达分析表明,OsGA3ox1 主要在未开的花中表达,OsGA3ox2 主要在未伸长的叶中表达。进一步对野生型(WT)和两个 ga3ox 突变体未开的花、未伸长的叶及根中的 GA 进行检测分析,发现 OsGA3ox1在花中催化 GA9形成 GA7与花粉育性密切相关;OsGA3ox2 在未伸长的叶中催化 GA20形成 GA1调控株高;OsGA3ox1 在根中催化 GA19形成 GA20,调控 GA3的生成。总之,
5、OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 响应发育信号,在不同组织分工协作合成内源 GA,调控水稻生长和发育。本研究为阐明 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 在 GA 生物合成中的作用以及深入理解 OsGA3ox 的功能提供参考。关键词:水稻;赤霉素;赤霉素 3 羟化酶基因;功能分析 846 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 OsGA3ox genes regulate rice fertility and plant height by synthesizing diverse active GA Xiaohua Hao1,2,Shuang Hu2,Dan Zh
6、ao2,Lianfu Tian2,Zijing Xie2,Sha Wu2,Wenli Hu2,Han Lei2,Dongping Li2 1.Plant Product Deep Processing Technology Innovation Team,College of Life and Environmental Sciences,Hunan University of Arts and Science,Changde 415000,China 2.College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha 410081,China
7、 Abstract:Gibberellin(GA)is an important hormone,which is involved in regulating various growth and development.GA biosynthesis pathway and synthetase have been basically clarified.Gibberellin 3 hydroxylase(GA3ox)is the key enzyme for the synthesis of various active GA.There are two GA3ox genes(OsGA
8、3ox1 and OsGA3ox2)in rice,and their physiological functions have been preliminarily studied.However,it is not clear how they work together to synthesize active GA to regulate rice development.In this study,the knockout mutants ga3ox1 and ga3ox2 were obtained by CRISPR/Cas9 technology.The pollen fert
9、ility of ga3ox1 decreased significantly,while the plant height of ga3ox2 decreased significantly.It shows that OsGA3ox1 is necessary for normal pollen development,while OsGA3ox2 is necessary for stem and leaf elongation.Tissue expression analysis showed that OsGA3ox1 was mainly expressed in unopened
10、 flowers,while OsGA3ox2 was mainly expressed in unexpanded leaves.The GA in different tissues of wild type(WT),and two ga3ox mutants were detected.It was found that pollen fertility is most closely related to the content of GA7,and plant height is most closely related to the content of GA1.It was fo
11、und that OsGA3ox1 catalyzes GA9 to GA7 in flowers,which is closely related to pollen fertility;OsGA3ox2 catalyzes the GA20 to GA1 in unexpanded leaves,thereby regulating plant height;OsGA3ox1 catalyzes the GA19 to GA20 in roots,regulating the generation of GA3.OsGA3ox1 and OsGA3ox2 respond to develo
12、pmental and environmental signals,and cooperate to synthesize endogenous GA in different tissues to regulate rice development.This study provides a reference for clarifying its role in GA biosynthesis pathway and further understanding the function of OsGA3ox.Keywords:Oryza sativa L.;gibberellin(GA);
13、OsGA3ox;functional analysis 赤霉素(gibberellin,GA)是一类四环二萜类激素,参与高等植物的生长发育过程,如调控株高、种子萌发、雄性育性和免疫等16。GA 在植物、真菌和细菌中都有分布,迄今为止已发现超过 130 种,最为常见的活性形式包括 GA1、GA3、GA4和 GA77。早期研究发现,水稻穗中存在高水平的 GA8。Kobayashi 等9进一步对水稻地上部分和穗中内源GA 的种类和水平的动态变化规律进行研究,发现地上部分 GA19含量最高,GA1、GA20、GA29和 GA53次之;抽穗期的地上部分(含穗)中还发现了 GA34和活性形式的 GA4和
14、GA7的混合物 GA4/7。GA4/7主要存在花药中,灌浆的种子中少10。雄性不育水稻花药中内源 GA4/7的含量在抽穗前 12 天快速增加,暗示与花粉发育相关11。两系温敏不育系(Norin PL12)在可育条件下,花药中检测到高水平的 GA4/7,而在不育条件下,随着雄性不育性的增加,GA4/7水平显著降低,表明 GA4/7与花药/花粉的发育密切相关12。然而,GA4和 GA7在花药发育,尤其是花粉育性调控中是否都起作用仍不清楚。目前,GA 代谢和信号通路的关键基因已经被鉴定。在 GA 合成中起重要催化活性的酶有 7 种,分别为柯巴基焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphospha
15、te synthase,CPS)、贝 壳 杉 烯 合 成 酶(ent-Kaurene synthase,KS)、贝壳杉烯氧化酶(ent-Kaurene oxidase,KO)、贝壳杉烯酸氧化酶(ent-Kaurenoic acid oxidase,KAO)、GA20氧化酶(GA20ox)、GA3羟化酶(GA3ox)第9期 郝小花等:OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 847 及 GA2氧化酶(GA2ox)13。在 GA 信号通路中,GID1(gibberellin insinsitive dwarf 1)是 GA 的受体蛋白,DELLA 蛋白是 GA 信号抑制因子,GI
16、D2 是能泛素化 DELLA 的 E3 泛素连接酶。GA 与 GID1 结合后,能够与 DELLA 结合,通过 26S 蛋白酶体介导的泛素化途径降解 DELLA 蛋白,从而启动 GA 响应基因的表达1416。植物 GA 代谢或信号通路过程中关键基因突变,使得体内活性 GA 水平不足,或GA 信号传递受阻,导致植物生长发育缺陷,如矮化、深绿色小叶、萌发延迟、根生长迟缓、开花延迟、种子减少、雄性育性下降等13,1720。如 SD1 是绿色革命基因,由 OsGA20ox2 编码,其突变体 sd1 呈现半矮杆表型20,d1821、dx22、gid114,15等突变体呈现矮杆表型。活性 GA 的合成依赖
17、于赤霉素 3-羟化酶,水稻中有两个赤霉素 3-羟化酶基因 OsGA3ox1 和OsGA3ox221。OsGA3ox1位于 5号染色体,OsGA3ox2与 D18 基因座等位,位于 1 号染色体上,该基因突变导致植株变矮23。OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 具有体外催化 GA20-GA1、GA5-GA3、GA9-GA4、GA20-GA1和 GA44-GA38步骤的活性。间接证据还显示,OsGA3ox1蛋白可以催化GA9形成2,3-dehydro-GA9,GA20形成 GA5;OsGA3ox1 还具有 2 羟化酶的活性,可以催化 GA1形成 GA8、GA4形成 GA3421。较早的研究暗示
18、 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 可能在水稻的不同组织中起作用,且具有不同的催化活性,但这两个基因在活性 GA 合成中如何分工协作至今未见系统报道9,21,24。本研究利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术,敲除水稻 GA 合成关键基因 OsGA3ox1 和OsGA3ox2 获得突变体材料,观察突变体表型,分析OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因的表达模式,并对其不同部位的多种内源 GA 含量进行测定,系统研究了两个 GA 合成关键酶在水稻不同部位、不同发育阶段的催化活性,及水稻不同部位的主要活性 GA 形式和功能。1 材料与方法 1.1 实验材料 供试水稻材料为粳稻品种(
19、Oryza sativa L.sub.japonica cv.Kitaake),由作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室提供。水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑系统由北京大学瞿礼嘉教授惠赠。敲除突变体材料ga3ox1 和 ga3ox2 经基因编辑而成,以 Kitaake 作为野生型对照(wild type,WT)。水稻材料种植在湖南师范大学试验田,种植期间按照大田常规栽培管理。1.2 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因表达 利用 Trizol(美国 Invitrogen 公司)提取水稻幼苗期的根、地上部分,分蘖期的成熟叶、未伸长的叶,孕穗期茎和未开的花总 RNA,参照 cDNA
20、反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书,反转录获得 cDNA 第一条链,并进行半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR,以 OsActin2 作为内参基因。利用Primer 6.0 设计所需引物(表 1)。半定量 RT-PCR 扩增体系为 20 L,包含模板 1 L、上下游引物(10 mol/L)各 0.5 L、2PCR Mix 10 L 和 ddH2O 8 L。实时荧光定量 PCR 扩增体系和程序按照试剂盒(Go Taq qPCR Master Mix,美国 Promega 公司)说明书进行,实验在定量 PCR 仪(QuantStudio 5,美国 ABI 公司)中进行,每个样
21、品设 3 个重复,每个实验重复 3 次。1.3 ga3ox1 和 ga3ox2 突变体植株的获得 利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统获得敲除突变体 ga3ox1 和 ga3ox2。分别在 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2的外显子区域各设计两个靶位点(表 1),构建基因编辑 载 体 OsGA3ox1-Cas9-1、OsGA3ox1-Cas9-2 及OsGA3ox2-Cas9-1、OsGA3ox2-Cas9-2,重组载体构建参考 Miao 等25方法。将构建好的基因编辑载体转入农杆菌感受态 EHA105 中,应用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤组织,通过抗性筛选、诱导分化获得水稻基
22、因编辑植株。进一步对基因编辑植株的靶位点进行 PCR 扩增、测序,测序结果与基因组序列比对确定转基因植株靶位点的碱基变化情况。1.4 GUS 转基因植株的获得和组织化学显色 根据 NCBI 数据库,设计引物(表 1)克隆OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因 ATG 上游约 2 kb 的序列作为 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 的启动子。将扩增的序列重组到pCambia1301载体中,构建OsGA3ox1-GUS 和 OsGA3ox2-GUS 重组载体,并通过农杆菌介 848 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 表 1 本研究所用引物信息 Table 1
23、Primers used in this study 引物名称 引物序列(53)用途 OsGA3ox1-RT-PCR F:CGAGACCGAGCGGAAGA 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R:GCCGACGACGACGATGA OsGA3ox2-RT-PCR F:TTCTCCAAGCTCATGTGGTC 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R:GCATCTCCTTGTGAAACTC OsActin2-RT-PCR F:ATGTGCCAGCTATGTATGTC 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R:CGTTCAGCAGTGGTAGTGA OsGA3ox1-C
24、as9-1 F:GCCGGAGTCGCACGTGTGGA 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R:TCCACACGTGCGACTCCGGC OsGA3ox1-Cas9-2 F:CGATGAGAGCTCTGGGCGAG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R:CTCGCCCAGAGCTCTCATCG OsGA3ox2-Cas9-1 F:GCTCTGCTTCGACTTCCGGG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R:CCCGGAAGTCGAAGCAGAGC OsGA3ox2-Cas9-2 F:GAGAAGATGCGCGCCGTCCG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑
25、载体 R:CGGACGGCGCGCATCTTCTC OsGA3ox1-GUS F:GGTTTTCATGCCATGCCAAT 构建 GUS 表达载体 R:GCATGAACTCGTTGGCTA OsGA3ox2-GUS F:ATAGTCCTCGGCAAGAAG 构建 GUS 表达载体 R:CGACGACGACGACGAT 导的遗传转化法获得分别由 OsGA3ox1和 OsGA3ox2的启动子驱动 GUS 表达的 ProOsGA3ox1:GUS 和ProOsGA3ox2:GUS 植株。将 GUS 转基因植株按常规方法种植,取幼苗时期的根和地上部分,分蘖期的成熟叶和未伸长的叶,孕穗期的穗和茎等组织进行
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