长茎葡萄蕨藻益藻细菌筛选及性能评价.pdf
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1、筛选长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)益藻细菌并评价其促生长性能,验证菌株对藻体的促生长效果。【方法】通过16S rDNA测序和平板涂布法对养殖长茎葡萄蕨藻进行藻际细菌菌群多样性分析、藻际可培养细菌分离鉴定及其促生特性分析;将获得的菌株制成菌悬液,与长茎葡萄蕨藻培养液按照体积比1 400混合构建藻菌共生功能体,进一步验证菌株对藻体的促生效果。【结果】长茎葡萄蕨藻的附生细菌在门水平上以变形菌门和拟杆菌门为主要优势类群,分别占总菌的46.0%和41.2%;通过平板涂布法分离培养共获得9株细菌菌株,经鉴定属于8个属,分别为Formosa属、假鲁杰氏菌属(Pseudoruege
2、ria)、短杆菌属(Brevibacterium)、深海单胞菌属(Thalassomonas)、Tenacibaculum属、鲁杰氏菌属(Ruggeria),弧菌属(Vibrio)和芽孢杆菌属(Bacillus),其中6株具有溶解有机磷能力的菌株分属于Formosa属、假鲁杰氏菌属、短杆菌属、鲁杰氏菌属和弧菌属,5株具有溶解无机磷能力的菌株分属于Formosa属、短杆菌属、深海单胞菌属和芽孢杆菌属,3株具有固氮能力的菌株分属于假鲁杰氏菌属、Tenacibaculum属和弧菌属,1株具有产吲哚-3-乙酸(IAA)能力和1株可以生产铁载体的菌株依次分属于弧菌属和深海单胞菌属。在藻菌共培养中,菌株C
3、l-9菌悬液可极显著地促进长茎葡萄蕨藻的生长(P 0.01)。【结论】筛选出一株长茎葡萄蕨藻益藻细菌(Bacillus sp.Cl-9),该菌可以与长茎葡萄蕨藻构建稳定的共生体系,显著提高藻体的生长,具有应用于工厂化养殖的潜力。关键词:长茎葡萄蕨藻;藻菌共生;藻际菌群;促生菌中图分类号:Q939.9文献标志码:A文章编号:1673-9159(2023)04-0084-09doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2023.04.011Screening and Performance Evaluation of Beneficial Bacteria fromCaulerpa
4、lentilliferaWANG Si-pan1,CHEN Bai-an1,HUANG Yong-jian1,LIN Kun1,CUI Jian-jun1,2,LIU Dong-chao1,2(1.Guangdong Ocean University,College of Fisheries,Zhanjiang 524088,China;2.Engineering TechnologyResearch Center for Algae Breeding and Application of Guangdong Province,Zhanjiang 524025,China)Abstract:【
5、Objective】To screen the beneficial bacteria of Caulerpa lentillifera,evaluate its growth-promoting ability,and verify the growth-promoting effect of the strains on the algae.【Method】Thestudy examined the diversity of the bacterial community in the algal sphere of C.lentillifera,theisolation and iden
6、tification of cultivable bacteria in the phycosphere,and their growth-promotingcharacteristics by 16S rDNA sequencing and plate coating method.To further demonstrate the strainsability to promote the growth of C.lentillifera,the bacterial suspension was prepared and combined第4期王思盼等:长茎葡萄蕨藻益藻细菌筛选及性能评价
7、with the C.lentillifera culture medium at a volume ratio of 1:400.【Results】The findings revealedthat Proteobacteria and Bacteroidetes,accounting for 46.0%and 41.2%of the total bacteria,respectively,were the predominant epiphytic bacteria at the phylum level.Using the plate coatingseparation method,n
8、ine strains were isolated and cultured for further examination.Based on analysesof 16S rDNA gene sequences,these strains were affiliated to the genera:Formosa,Pseudoruegeria,Brevibacterium,Thalassomonas,Tenacibaculum,Ruggeria,Vibrio and Bacillus,respectively.Moreover,among the examined strains,6 str
9、ains capable of dissolving organic phosphorus were classified into theFormosa,Pseudoruegeria,Brevibacterium,Ruggeria and Vibrio.5 strains capable of dissolving inorganicphosphorus were classified into the Formosa,Brevibacterium,Thalassomonas and Bacillus.3 strainscapable of fixing nitrogen were clas
10、sified into the Pseudoruegeria,Tenacibaculum and Vibrio.1 straincapable of producing indole-3-acetic acid and 1 strain capable of producing siderophores were classifiedinto the Vibrio and Thalassomonas,successively.The outcomes demonstrated that the suspension of strainCl-9 aided the growth of C.len
11、tillifera very significantly(P 0.01).【Conclusion】The Bacillus sp.Cl-9strain had the potential to be used in factory culture because it could create a reliable symbioticrelationship with C.lentillifera and greatly enhance the growth of the algae.Key words:Caulerpa lentillifera;algal-bacterial symbios
12、is;microflora in phycosphere;growth-promoting bacteria大型海藻藻体表面会附着大量微生物,这些微生物的群落组成受到地理位置、海洋理化指标以及海藻本身的生长阶段等影响1-2。它们以海藻为中心,由藻、菌以及二者分泌的多糖和多种活性物质构成特别的藻际微环境3-4。藻际微生物与海藻之间形成藻菌共生功能体,从而影响彼此的生理、生长和代谢产物等5,二者之间的关系可分为偏利共生、共栖、互利共生以及相互拮抗6。有益微生物对海藻的促生作用按照作用方式可分直接和间接两种,直接作用是指微生物通过产生信号分子、提供营养元素等方式来直接促进海藻生长7-8;间接作用是指
13、微生物通过自身代谢作用激活植物防御系统、分泌代谢产物来抵抗病原菌,以减少海藻病害的发生5-6,9-10。长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)是一种生长在潮间带的大型经济绿藻,具有较高的医药、食品以及水质净化等应用价值11-14,其在工厂化养殖过程中存在病害频发、高品质藻体较少等问题15-16。Kopprio等17通过高通量测序对健康与患病的长茎葡萄蕨藻进行对比发现,附生细菌群落的改变与长茎葡萄蕨藻病害的发生密切相关。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的暴发也可引发养殖长茎葡萄蕨藻的黑褐病16。迄今为止,国内外学者对海藻的病害研究主要在病原微生物方面18,
14、对益藻细菌的相关研究鲜有报道。利用有益微生物与宿主之间的互利关系来改善微生态,引导微生物群落正向演替进而促进宿主生长,提高宿主对病害的免疫力,在农业生产和微藻工业中已经得到应用19-21,但是在大型海藻中研究报道较少。本研究采用16S rDNA技术分析健康长茎葡萄蕨藻的细菌群落结构和多样性,对长茎葡萄蕨藻的共附生细菌进行分离培养,并基于16S rDNA基因测序鉴定其分类地位,构建藻菌共生系统实验验证菌株的益藻效果,以期提高长茎葡萄蕨藻规模化养殖的产量,为大型海藻的益藻细菌应用提供理论基础。1 材料与方法1.1 藻种来源长茎葡萄蕨藻藻种购买于广东省深圳市蓝汀鼎执生物科技有限公司,长期培养于广东海
15、洋大学藻类资源开发与养殖环境生态修复实验室(室内养殖),在2021年7月将藻种转移至广东海洋大学东海岛实验基地室外半流水养殖高位池内进行室外培养2个月。1.2 培养基2216E液体培养基、2216E琼脂培养基、无氮培养基、有机磷细菌培养基(不含琼脂)、无机磷培养基(不含琼脂),青岛海博生物科技有限公司;CAS检测培养基,上海瑞楚生物科技有限公司。1.3 长茎葡萄蕨藻的藻际菌群多样性分析采集室外生长状况良好、颜色鲜绿的长茎葡萄蕨藻,使用灭菌海水冲洗2 3次去除藻体表面附着85第43卷广东海洋大学学报的杂物。将清洗好的藻体放入无菌密封袋中置于液氮运输至实验室,后将样品送交至广州基迪奥生物科技有限公
16、司进行藻体的共附生细菌 16SrDNA多样性测序分析。1.3 长茎葡萄蕨藻共附生细菌分离培养将上述长茎葡萄蕨藻使用灭菌海水冲洗2 3次后,装入无菌密封袋中低温运输至实验室。在无菌超净台中,选取2 g海藻样品置于研钵,加入5 mL无菌海水(先经孔径0.22 m滤膜过滤,后在121 下灭菌30 min,下同)。充分研磨后用无菌海水进行稀释,采用平板涂布法将稀释液涂布于海水2216E琼脂平板。将平板在28 生化培养箱中倒置培养直至无新菌落生成。挑取颜色、形态不同的单菌落进行划线纯化至无形态不同的杂菌长出,获得纯培养菌株。1.4 菌株生长曲线绘制分别接种9株细菌至装有2216E液体培养基的250 mL
17、锥形瓶中(装液量为 150 mL),每株细菌设置3组平行,培养条件为25、150 rmin-1。在培养过程中,每3 h吸取1 mL菌液进行光密度值OD600 nm的测定,并绘制细菌生长曲线。1.5 长茎葡萄蕨藻的可培养细菌鉴定将上述分离获得的菌株培养至对数生长期后,用于DNA提取。使用微生物DNA提取试剂盒(安徽天根生化科技有限公司)从纯培养物中获得基因组DNA。利用细菌通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1 492R(5-TACGACTTAACCCCAATCGC-3)对获取的各菌株 16S rDNA 基因序列进行PCR扩增22。所有PCR产物送至生工生物工程(
18、上海)股份有限公司进行测序分析。测序获得的各菌株序列分别在NCBI中进行比对,使用MEGA11构建系统进化树,从而鉴定出分离菌株的属水平上的分类地位。1.6 长茎葡萄蕨藻共附生细菌益藻能力分析将分离获得的 9株细菌分别培养至 OD600 nm为0.8后备用。细菌解磷能力测定:将1 mL上述备用菌液分别转接至 10 mL 有机磷和无机磷液体培养基中,在28、150 rmin-1条件下恒温培养72 h后,将菌液置于8 000 rmin-1、4 条件下离心10 min,取上清液并使用孔径0.22 m滤膜进行过滤,利用钼锑抗比色法测定计算过滤液中磷含量23。菌株产吲哚-3-乙酸(IAA)能力测定:将备
19、用菌液等体积接入含有0.2 gL-1L-色氨酸的2216E液体培养基中,在28、150 rmin-1条件下,恒温震荡培养4 d后,将菌液置于8 000 rmin-1、4 条件下离心10 min,取1 mL上清液与Salkowski比色液按照体积比1 1的比例置于96孔板中,使用锡纸包裹后,置于恒温箱中黑暗反应 30 min;将反应液迅速置于530 nm处测定光密度值,并计算菌株产IAA的量24。细菌固氮能力检测:将备用菌液分别点接于无氮(海水)固体培养基中,28 恒温倒置培养72 h,观察是否有菌落生成。菌株产铁载体能力检测:将备用菌株在无铁2216E 液体培养基中活化培养至 OD600 nm
20、为 0.8后,参考王卫星等25的方法,利用无铁2216E琼脂培养基和CAS检测培养基相结合的平板覆盖法进行细菌产铁载体检测,并记录黄色铁载体晕圈的大小。1.7 长茎葡萄蕨藻共附生细菌的益藻能力验证参考Li等26研究方法构建藻菌共生体系,挑选长势良好、色泽鲜绿的长茎葡萄蕨藻,剪取(25 5)mm的直立枝作为实验对象。将剪好的直立枝使用无菌海水反复冲洗干净,置于温度(25 1)、照度(3 000 200)lx、光暗周期12 h:12 h、盐度30 1的无菌海水中暂养3 d。将上述9株菌株在25、150 rmin-1的条件下培养至对数生长期,在4、6 000 rmin-1条件下离心5 min获得菌体
21、,将所得到的菌体沉淀用灭菌海水重悬洗涤3次去除培养基后,使用灭菌海水调节菌液OD600 nm至1.0备用。采用容积为480 mL的组织培养瓶作为培养容器,添加400 mL过滤灭菌的自然海水,其中分别加入1 mL NaNO3溶液(42.5 gL-1)与1 mL KH2PO4溶液(13.4 gL-1)作为营养盐。吸取配制好的9种菌液各1 mL,分别添加至实验组组织培养瓶中,以未添加菌液组为对照组,每个培养瓶所放藻的初始重量。除添加营养盐外,均与暂养时条件相同。每3 d重复添加相同浓度的菌液至培养液中,连续培养15 d,每天观测生长状况,15 d 后取出藻体擦干水分,称取最终质量。藻体的特定生长率(
22、SGR)参照王晓梁等27方法计算。培养15 d后按照王晓梁等27的方法测定藻体中色素含量;藻体中总蛋白、可溶性糖以及海藻糖含86第4期王思盼等:长茎葡萄蕨藻益藻细菌筛选及性能评价1 8001 5001 20090060030008.06.44.83.21.60.0香农指数Shannon index发现物种数Number of speciesdiscovered序列数 Read numbers0.02.01044.01046.01048.0104序列数 Read numbers0.02.01044.01046.01048.0104图1健康长茎葡萄蕨藻细菌菌群的稀释曲线和香农指数曲线Fig.1Di
23、lution curve and Shannon index curve of bacteriaflora in Caulerpa lentillifera量的测定均严格按照南京建成生物研究所的试剂盒操作说明进行。1.8 数据的处理与分析采用IBM SPSS Statistics 24软件对数据进行统计分析。通过单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(P Cl-4Cl-2Cl-9Cl-5;按照其转化有机磷量由大到小排序为:Cl-8Cl-4Cl-2Cl-1Cl-3Cl-7,其中Cl-1和Cl-4兼具溶解有机磷、无机磷的能力。此外,菌株 Cl-8还具有生
24、产 IAA 的能力,可达 17.61 mgL-1;菌株Cl-3、Cl-6和Cl-8可以在无氮固体培养基上生长,具有固氮能力;菌株Cl-5具有产生铁载体的能力,铁载体分泌圈直径为3.83 cm。综上,长茎葡萄蕨藻的藻际细菌在促进海藻生长方面具有一定的应用潜力。2.4 藻菌共生体系对长茎葡萄蕨藻生长的影响将长茎葡萄蕨藻分别与所分离获得9株细菌构建藻菌共培养体系,进行为期15 d的连续共培养。由图5可以看出,9株细菌中菌株Cl-9的添加对长茎葡萄蕨藻的SGR有极显著的促进效果(P 0.05)。此外,菌株 Cl-5和 Cl-7的添加极显著提高了长茎葡萄蕨藻叶绿素a的含量(P 0.01),与对照组相比分
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