一株海泥来源真菌Talaromyces flavus 210331次级代谢产物及其抗氧化活性.pdf
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1、Journal of HaianNormalUnivralScience2023年6 月Jun.2023Vol.36 No.2第36 卷第2 期海南师范自然科学版)Doi:10.12051/j.issn.1674-4942.2023.02.005-株海泥来源真菌Talaromycesflavus210331次级代谢产物及其抗氧化活性陈炜康12,罗运展1-2,陈世季12,黄国雷12,李诗川3,郑彩娟1-2(1.海南师范大学化学与化工学院/热带药用资源化学教育部重点实验室,海南商海口571158;2.海南省热带药用植物化学重点实验室,海南海口571158;3.海南东寨港国家级自然保护区管理局,海南
2、海口571129)摘要:为从Talaromyces属中获得更多生物活性显著的次级代谢产物,对一株红树植物白骨壤(Avicenniamarina)根际海泥来源真菌Talaromycesflavus210331的次级代谢产物及其抗氧化活性进行研究。综合利用正相硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析、半制备HPLC等色谱分离技术,对该菌发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行次级代谢产物分离纯化;综合运用NMR、M S波谱对纯化的次级代谢产物进行结构鉴定,并评价鉴定次级代谢产物的抗氧化活性。结果显示从真菌T.flavus210331中分离鉴定7 个单体化合物,包括2 个异香豆素类化合物hypoxyma
3、rinC(1)和penicisocoumarin F(2),1个联烯类化合物penicilactone A(3),4个苯衍生物diorcinol(4)、p-h y d r o x y-benzaldenhyde(5)、t r a n s-f e r u l i c a c i d(6)和agidol10(7)。抗氧化活性测试结果表明化合物1 3具有显著的抗氧化活性,其ICs值分别为(0.18 0 0.0 2 5)、(0.18 0 0.0 37)和(0.2 30 0.0 13)mmol/L,强于阳性对照troloxICso=(0.2900.011)mmol/L。关键词:海泥;Talaromyce
4、sflavus;次级代谢产物;抗氧化活性中图分类号:R281.4文献标志码:A文章编号:16 7 4-49 42(2 0 2 3)0 2-0 138-0 5Secondary Metabolites and Their Antioxidant Activities of a SeaMud-derived Fungus Talaromyces flavus 210331CHEN Weikangl2,LUO Yunzhan1-2,CHEN Shiji1-2,HUANG Guoleil:2,LI Shichuan,ZHENG Caijuan1:2(1.Key Laboratory of Tropic
5、al Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education,College of Chemistry andChemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou 571158,China;2.Key Laboratory of Hainan Provincial Tropical Medicinal Phytochemistry,Hainan Normal University,Haikou571158,China;3.Hainan Dongzhaigang National Nature
6、 Reserve Administration,Haikou 571129,China)Abstract:In order to obtain more secondary metabolites with significant biological activities from the genus Talaromyces,the secondary metabolites and biological activities of the fungus Talaromyces flavus 210331 isolated from sea mud of therhizosphere of
7、Avicennia marina were studied.The secondary metabolites were isolated and purified by normal phase sili-收稿日期:2 0 2 2-11-2 1基金项目:海南省重大科技计划项目(ZDKJ202008);国家自然科学基金项目(32 16 0 10 8);海南省院士创新平台科研专项(YSPTZX202030)第一作者:陈炜康(19 9 9),重庆人,硕士研究生,研究方向为天然药物化学。E-mail:*通信作者:郑彩娟(19 8 3),山东潍坊人,教授,研究方向为天然药物化学。E-mail:139第
8、2 期-株海泥来源真菌Talaromycesflavus210331次级代谢产物及其抗氧化活性陈炜康,等:ca gel column chromatography,Sephadex LH-20 gel column chromatography,semi-preparative HPLC and other chro-matographic separation methods from the EtOAc extracts.Their structures were identified by comprehensive NMR,MSspectral and other spectral a
9、nalysis methods.The antioxidant activities of the isolated secondary metabolites were alsotested.Seven compounds were isolated and identified from T.flavus 210331,including two isocoumarins hypoxymarin C(1),penicisocoumarin F(2)a diene penicilactone A(3),four benzene derivatives diorcinol(4),p-hydro
10、xy-benzaldenhyde(5),trans-ferulic acid(6),and agidol 10(7).Compounds 1-3 showed good antioxidant activity,with the ICso values of0.18+0.025,0.180.037 and 0.230.013mmol/L,respectively,better than positive control trolox with the ICso value of0.290.011 mmol/L。Keywords:sea mud;Talaromyces flavus;second
11、ary metabolites;antioxidant activity海洋环境高压、低温、高盐、寡营养的特殊性赋予了海洋微生物有别于陆生微生物的代谢途径及适应机制,从而产生结构独特、生物活性显著的次级代谢产物,因此海洋是药物先导化合物的重要来源,被认为是天然药物资源的新宝库1-1。海洋来源蓝状属真菌Talaromyces能够产生结构新颖且生物活性独特的次级代谢产物,如从该属真菌中发现具有抗人类致病菌活性的3,15-dihydroxyl-(22E,24R)-ergosta-5,8(14),22-trien-7-one2、抗炎活性的rubratoxin acid A3、抗伪狂犬病病毒(PRV)活
12、性的talaromyolide DI、抑制胃癌细胞MCC803和MKN28以及金黄色葡萄球菌的taladrimanin A5。为从Talaromyces属真菌中分离获得更多生物活性显著的次级代谢产物,从红树植物白骨壤(Avicennia marina)根际海泥的真菌T.flavus210331中分离鉴定出7 个化合物(1 7),结构分别为:hypoxymarinC(1)、p e n i c i s o c o u ma r i n F(2)p e n i c i l a c t o n e A(3)d i o r c i n o l(4)p-hydroxy-benzaldenhyde(5)、t
13、 r a n s-f e r u l i c a c i d (6)和 agidol 10(7)(图 1)。R1R2415313OH.OH4a32245338aOH71OH785516R3HO877R1 R2 R31 OH HOH342 OH OH H99OH10776176622335484OH1111131313567图1化合物1 7 的化学结构Figure1Structures of compounds 1-71材料与方法1.1仪器与试剂GAA076LC质谱仪,瑞士Bruker公司;Agilent1100分析型高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;EYELAN-100旋转蒸发仪,日本东京理化有
14、限公司;YOKO-ZK紫外分析暗箱,武汉药科新技术开发有限公司;Sepha-dexLH-20凝胶,英国AmershamBlosclences公司;BrukerAV-400MHz超导核磁共振仪,瑞士Bruker公司;恒温水浴锅B-220,上海亚荣生化仪器厂;薄层硅胶GF254、柱色谱硅胶,青岛海洋化工厂;总抗氧化能力检测1402023年海南师范大学学报(自然科学版)试剂盒(ABTS法),海南科贸生物科技有限公司;全波长多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;灭菌锅,上海申安医疗器械厂;超净台,苏州净化设备有限公司。实验操作过程中所使用的化学试剂均来自广州西陇化工股份有限公司。1.2菌株的分离与筛选1
15、.2.1菌株来源海泥采自海南东寨港国家级自然保护区红树植物白骨壤(Avicenniamarina)的根际部位(110.57 8 6 E,19.94909N),从海泥中分离、鉴定、筛选出一株命名为2 10 331的真菌。通过18 SrRNA扩增和ITS区域测序,结合真菌的形态特征将该真菌鉴定为Talaromycesflavus210331,序列数据已提交至GenBank,登录号为OP493180。菌种现保存于海南师范大学化学与化工学院热带药用资源化学教育部重点实验室(PDA培养基,4保存)。1.2.2菌株的培养菌株T.flavus210331经过活化后,分别接种到3瓶马铃薯液体培养基中(30 0
16、 mL/1000mL)以获得种子培养液,2 8 恒温振荡培养7 2 h。将9 0 0 mL种子培养液转移到50 瓶马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中(每个1L锥形瓶中含有1.8 g马铃薯葡萄糖浸粉和2 0 0 mL海水),静置培养(2 8,30 d)。1.3#提取与分离对发酵产物用纱布过滤,分为菌液和菌丝体,将菌液部分(2 0 L)用乙酸乙酯(EtOAc)萃取3次得到发酵液浸膏,菌丝体部分用甲醇(MeOH)萃取3次后,提取物经减压蒸发得到浸膏,然后用乙酸乙酯萃取,得到菌丝体部位乙酸乙酯浸膏。将发酵液浸膏和菌丝体浸膏通过薄层色谱分析(TLC)后发现,两者非常相似,将两部分浸膏合并得到总浸膏(9.
17、6 g)。总浸膏通过正相硅胶柱层析(7 5 12 0 m)梯度洗脱,用石油醚/EtOAc(u/b,梯度10 0:0 0:10 0)和Et0Ac/Me0H(v/v,梯度10 0:0 0:10 0)分成5个组分(Fr.1Fr.5)。Fr.2(1.2 g)通过正相硅胶柱(2 0 0 30 0 目)进行柱层析洗脱,使用石油醚/EtOAc(/u,9:11:1)梯度洗脱,通过TLC分析后合并为4个组分(Fr.2.1Fr.2.4);Fr.2.2(0.8g)通过SephadexLH-20凝胶柱(石油醚-CHCl,-MeOH,v/b,2:1:1),并经半制备HPLC分离纯化,得到化合物1(7.2 mg)、2(7
18、.3mg)和4(5.4mg)。Fr.4(1.8 g)经凝胶柱SephadexLH-20(CH Cl-M e 0 H,v/,1:1)洗脱,得到5个组分(Fr.4.1Fr.4.5);Fr.4.3(1.0g)经过正相硅胶柱(2 0 0 30 0 目)梯度洗脱后,通过半制备型HPLC纯化得到化合物3(6.6 mg)和5(13.2 mg)。组分Fr.5(1.1g)用正相硅胶柱(2 0 0300目)石油醚/Et0Ac(/v,5:10:1)梯度洗脱,得到3个组分(Fr.5.1Fr.5.3);Fr.5.2(0.4g)进行凝胶柱SephadexLH-20和半制备HPLC分离纯化,得到化合物6(11.4mg)和7
19、(10.2 mg)。1.4抗氧化活性测试参考文献6 的检测方法,测试化合物1 7 的抗氧化活性。PBS缓冲液作为空白对照,二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照,trolox为阳性对照,平行实验3次。使用全波长功能酶标仪测试7 34nm波长处的吸光度A,再根据公式抑制率=(AA空白-A样品)/A空白l100%,计算出各样品的抑制率并通过SPSS软件计算出ICso值。2结果与分析2.11化合物结构鉴定化合物1:黄色油状液体,低分辨质谱ESI-MS在mlz267.0处给出准分子离子峰M+H*,推测分子量为266.0,结合 HNMR和13NMR波谱数据,推断其相对分子式为Ci4Hi:0,不饱和度为6。核磁
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