滋肾清热利湿化瘀方调节C_EBPβ信号介导的颗粒细胞改善多囊卵巢综合征.pdf
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1、61江西中医药 2023 年 08 月第 8 期总第 54 卷第 488 期中药研究滋肾清热利湿化瘀方调节 C/EBP 信号介导的颗粒细胞改善多囊卵巢综合征梁瑞宁1 金晶2 丁志玲3 彭佳华3 孙雪燕4 江苗5 李佩双6(1.江西中医药大学第二附属医院 南昌330004;2.江西中医药大学研究生院 南昌330004;3.江西中医药大学中医妇产科学研究所 南昌333004;4.南昌县中医院 南昌330220;5.景德镇市第一人民医院 江西景德镇 333000;6.江西中医药大学附属医院 南昌333004)摘要目的:探讨滋肾清热利湿化瘀方(简称滋肾方)治疗多囊卵巢综合征(PCOS)可能机制。方法:
2、临床观察 PCOS患者滋肾方治疗 3 个月前后的血清性激素和脂质代谢水平变化;皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)诱导 PCOS 样大鼠模型,第22 天开始,滋肾方9.1g/(kgd)灌胃,持续 14d。HE 染色法观察卵巢组织病理学改变,并对黄体及囊性卵泡数量进行统计,Elisa 检测大鼠血清性激素和脂质代谢水平;滋肾方干预 PCOS 患者原代颗粒细胞(GCs),ITRAQ 蛋白质组学测序筛选差异蛋白;CCK8 和流式细胞术检测滋肾方干预下人卵巢颗粒细胞瘤(KGN)细胞的增殖和凋亡水平,并通过 Western 和qPCR 检测差异蛋白表达水平。结果:临床数据观察显示,与治疗前相比,滋肾方治疗后身体
3、质量指数(BMI),促黄体生成素(LH)、LH/卵泡刺激素(FSH)、雄激素(T)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)的水平降低(P0.05),FSH、高密度脂蛋白(HDL-C)的水平提高(P0.05);体内动物水平,与模型组相比,滋肾方提高了 PCOS 大鼠的 FSH 和HDL-C 水平(P0.05),降低了 LH、LH/FSH、T、TG 和 LDL-C 的水平(P0.05);ITRAQ 蛋白质组测序结果提示,C/EBP是具有高度的差异性和连接性;体外验证水平,滋肾方能促进 KGN 细胞的增殖(P0.05),抑制 KGN 细胞的凋亡(P0.05),提高 C/EBP 的表达(P0.0
4、5)。结论:滋肾方有效改善 PCOS 的性激素及脂质代谢水平,其机制可能是通过激活 C/EBP信号实现的。关键字滋肾方;卵泡发育;颗粒细胞;C/EBP;多囊卵巢综合征中图分类号:R285 文献标志码:A多 囊 卵 巢 综 合 征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是育龄妇女常见的内分泌和代谢性疾病之一,在全世界范围内影响高达 15%1。稀发排卵/无排卵、高雄激素血症、胰岛素抵抗等为其主要临床特征2。其中,卵泡发育不良是其核心病理。尽管PCOS 排卵障碍的确切发病机制尚不清楚,但大量的研究发现高雄激素血症、脂质代谢异常、胰岛素抵抗等因素与卵泡发育不良密切相关3-5。颗粒细
5、胞围绕于卵母细胞周围,通过缝隙连接、旁分泌等多种方式与卵母细胞相互作用。颗粒细胞分泌的蛋白质、类固醇和多糖等物质是卵泡液的重要成分,为卵母细胞的生长发育提供了适宜的微环境6-7。研究发现颗粒细胞在高雄激素血症、脂质代谢异常和胰岛素抵抗的介导下,影响卵泡发育,导致排卵障碍,最终导致 PCOS8。PCOS 属中医“闭经”“不孕”“癥瘕”等范畴,本课题组结合多年的临床治疗认为 PCOS 病机多为肾虚兼湿热、痰浊、瘀血,也即肾虚为本,痰瘀湿浊等为标,致冲脉血气“逆盛”。在本课题组前期研究发现滋肾方能有效提高 PCOS患者自主排卵率及有排卵月经的发生率,并能改善痤疮及降低血清睾酮水平9。故本研究拟从滋肾
6、方干预 PCOS 患者及 PCOS 模型大鼠,明确滋肾方治疗有效性的基础上,基于 ITRAQ 蛋白组学探究滋肾方干预 GCs 治疗 PCOS 的作用机制,并通过 KGN细胞系验证关键信号在滋肾方干预后的变化水平,期望有助于阐明滋肾方治疗PCOS的可能作用机制,为中医药治疗 PCOS 提供新的思路。1 材料1.1 临床资料回顾性选取 2019 年 12 月2021 年 12 月江西中医药大学附属医院 30 例 PCOS 患者为研究对象,按照治疗前后分为治疗前组与治疗后组。病例诊基金项目:国家自然科学基金项目(81560783,81860865,82060880);江西省中医妇产科疾病临床医学研究
7、中心基金项目(20181BCG42003);梁瑞宁全国名老中医药专家传承工作室项目(国中医药人教函202275 号);江西省中医妇产科疾病临床医学研究中心项目(20181BCG42003);江西中医药大学科技创新团队发展计划项目(CXTD22013)。第一作者:梁瑞宁,博士,教授,博士生导师。E-mail:。62JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究断标准采用 2003 年 ESHRE/ASRM 鹿特丹 PCOS 诊断标准。本研究经江西中医药大学附属医院伦理委员会的批准。1.2 动物30 只 SPF 级雌性 SD 大鼠,体质量 2
8、00240g,由自安徽医科大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCXK(皖)2017-001。严格根据实验室动物喂养标准要求常规饲养。1.3 GCs 和 KGN 细胞GCs 由南昌市生殖医院 40 位接受 IVF/ICSIPCOS 患者提供,PCOS 患者纳入和排除标准严格按照鹿特丹标准。研究获得了患者知情同意,并得到南昌市生殖医院伦理委员会的批准;KGN 细胞系由江西省妇幼保健院提供。1.4 药物滋肾方组成和用量:知母 10g,山茱萸 10g,丹参 10g,桃仁 10g,薏苡仁 15g,白芥子 10g,黄柏 10g,玄参 10g,甘草 6g,购自于江西省中医院中药房;DHEA(纯度:99%,
9、货号:qP-2164)购自武汉华美生物工程有限公司。1.5 主要试剂瑞氏-姬姆萨复合染色液(北京雷根生物技术有限公司);DMEM(上海达特希尔生物科技有限公司),胎牛血清(普诺赛);LH、FSH、T、HDL-C、LDL-C 和 TGElisa 试剂盒(武汉华美生物工程有限公司);iTRAQ 试剂盒(中科);C/EBP抗体(Abcam 公司)。1.6 仪器ADVIA1650全自动生化分析仪(西门子公司);MR-96A 酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);伯乐电泳仪(Biorad 公司);凝胶成像系统(Biorad 公司)。2 方法2.1 滋肾方干预 PCOS 患者性激素、脂代谢水平检测本
10、研究共纳入 30 例用滋肾方治疗的 PCOS 患者。给药方法:每日 1 剂,早晚各 1 次,共 3 个月。月经周期第 35 天采集静脉血测定 LH、FSH 及 T性激素水平;脂代谢指标,嘱患者禁食 8h 以上,于次日清晨 8:00 采集静脉血检测 TG、HDL-C 及LDL-C 脂代谢水平。2.2 滋肾方干预 PCOS 大鼠 HE、性激素和脂代谢水平检测2.2.1 模型构建及给药 取 20 只大鼠根据文献构建PCOS 模型10-11,10 只为对照组。配制 0.6g/kg 的DHEA,每次注射前用 0.2mL 大豆油稀释后注射于大鼠颈背部皮下,每天1次。灌胃第1221天每日9:00进行大鼠阴道
11、脱落细胞涂片,显微镜下观察动情周期以评估造模是否成功。以动情周期紊乱或持续处于动情间期提示无排卵,初判 PCOS 模型建立成功。将最终建模成功的 20 只大鼠,随机分为模型组和滋肾方组,每组 10 只。根据人鼠药物剂量换算出大鼠所需药量。滋肾方常规中药煎煮后 9.1g/(kg d)灌胃治疗,模型组等体积生理盐水灌胃,连续 14d。2.2.2 取材及指标测定 末次给药后 24h,戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉取血。卵巢组织置于 4%多聚甲醛中固定,包埋后制成 4m 厚的组织切片,常规 HE 染色,中性树胶封片,光镜下观察卵巢组织病理变化,对每只大鼠的黄体及囊性卵泡个数进行统计。离心、收集大鼠血液上
12、清液,-20保存血清备用。ELISA 试剂盒检测 LH、FSH、T、TG、HDL-C 和 LDL-C 水平,并计算 LH/FSH 比值。2.3 滋肾方干预 GCs 蛋白质组学研究2.3.1滋肾方干预 GCs 及 iTRAQ 差异蛋白的筛选 采用密度梯度法分离需行 IVF/ICSIPCOS 患者卵泡液中颗粒细胞,根据是否给与滋肾方干预分为PCOS组与滋肾方组。预热培养基洗涤颗粒细胞2次,放入 37,5%CO2培养箱中培养 2d 以去除混杂的血细胞。根据常规方法制备肠吸收液12-13。细胞贴壁后,0.2%滋肾方肠吸收液干预 GCs48h 后提取蛋白。采用 PierceTMTop12Abundant
13、ProteinDepletionSpinColumns(Thermo)去高丰度试剂盒提取蛋白。蛋白质浓度用考马斯亮蓝染色法测定,采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法评价样品质量。对样本进行纳升液相-串联质谱分析。每份样品经过高效液相色谱分离后进行质谱分析。使用 ProteinPilotSoftware4.2 软件查找数据库 uniprot-human.Fasta,得到差异结果。P0.05 视为差异具有统计学意义。2.3.2 生物信息学分析 使用在线分析网站 DAVID来分析 2 组差异表达蛋白中的 GO 功能注释结果,采用 Kobas 软件对 2 组差异表达蛋白谱进行 KEGG通路富集分析。2.
14、4 滋肾方干预体外验证结果2.4.1 KGN 细胞培养及处理 KGN 细胞培养在含有高糖 DMEM 并添加 10%胎牛血清以及 1%青-链霉素,细胞在温度为 37的恒温 CO2孵箱中培养。分别将对照组,0.05%、0.01%、0.2%滋肾方组的 KGN 细胞接种于 96 孔板(3103个/孔)。在 0、12、24、48h 评估细胞增殖活性。待作用时间完成后,在培养孔中加入 CCK-8 溶液,孵育 2h63江西中医药 2023 年 08 月第 8 期总第 54 卷第 488 期中药研究后,450nm 读取吸光度。2.4.2细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法,收集细胞悬液,PBS 清洗 2 次,加入
15、 1BindingBuffer制成细胞悬液,流式管中加入 100L 的细胞悬液,依次加入 5LAnnexinV 和5L7-AAD,室温中避光孵育 10min 后加入 400L 的 1BindingBuffer,混合均匀后流式细胞仪检测细胞凋亡结果,FlowJo版本 V10 分析数据。2.4.2 RT-qPCR 检测差异蛋白表达量 根据按照试剂盒说明书步骤提取 RNA,并测得 RNA 浓度,逆转录后选用 GAPDH 作为内参,检测 C/EBP 表达情况,并通过扩增曲线得到 CT 值,以 2-CT法进行相对定量分析,引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成,引物序列见表 1。表1 引物序列引物名称引物
16、序列引物长度/bPC/EBP反向5 GGAAAGAGTATGCCAAGGGAG-3189正向 5-GCAAGCTGTGATGGTTTCC-3189GAPDH反向 5-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3114正向 5-GAAGGCTGGGGCTCATTT-31142.4.3 WesternBlot 检测差异蛋白表达量 WesternBlot 检测差异蛋白表达水平。细胞培养瓶中加入高效裂解液,孵育 30min,超声匀浆机破碎匀浆,于超速冷冻离心机 4、13000r/min 离心 30min取上清。BCA 法测定样本组织中蛋白浓度,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,湿法转膜,脱脂奶粉封闭,根据
17、GAPDH(11000)、C/EBP(11000)抗体说明书进行抗体稀释,4孵育过夜后,加入相应的二抗,室温反应 2h,ECL 超敏溶液显影,采用ImageJ 图像处理软件计算对应凝胶条带的灰度值,与内参 GAPDH 的吸光度比值用于统计分析。2.5 统计学方法统计数据采用 SPSS22.0 软件处理,检测结果以表示,组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用 Tukey 检验,以 P0.05 表示差异具有统计学意义。3 结果3.1 滋肾方对 PCOS 患者性激素、脂代谢水平影响与治疗前比较,治疗后患者 BMI、LH、LH/FSH 和 T 水平下调,FSH 水平上调(P0.05);脂代谢水平,与
18、治疗前比较,治疗后患者 LDL-C 和TG 水平下降,HDL-C 水平上升(P0.05)。见表 2、表 3。表2 PCOS患者治疗前后FSH、LH、LH/FSH和T水平情况(xs,n=30)时间BMI/(kgm-2)FSH/(mIUmL-1)LH/(mIUmL-1)LH/FSHT/(nmolmL-1)治疗前24.592.486.321.0013.515.562.031.120.690.26治疗后22.871.45*6.951.07*9.906.06*1.371.01*0.540.22*注:与治疗前比较,*P0.05。表3 PCOS患者治疗前后TG、HDL-C和LDL-C水平情况(xs,n=30
19、)mmol/L时间TGHDL-CLDL-C治疗前1.840.231.700.081.770.34治疗后1.550.11*2.110.37*1.440.20*注:与治疗前比较,*P0.05。3.2 滋肾方对 PCOS 大鼠 HE、性激素和脂代谢水平影响3.2.1 滋肾方对 PCOS 大鼠卵巢组织病理学影响 病理学观察发现,对照组大鼠可见多个黄体及不同等级发育的优势卵泡,颗粒细胞呈多层且排列规则整齐。与对照组比较,模型组小鼠囊状卵泡增多,卵母细胞、黄体数量、卵泡颗粒细胞层数减少。与模型组相比,滋肾方组给药 14d 后可见囊状卵泡明显减少,内见黄体,卵巢颗粒细胞正常排列。且各组卵巢组织黄体及囊性卵泡
20、数量统计可见,与对照组相比,模型组黄体数量下降(P0.05),囊性卵泡数量明显升高(P0.05),与模型组相比,滋肾方组黄体数量上调(P0.05),囊性卵泡数量明显下调(P0.05),结果提示滋肾方可明显缓解 PCOS 大鼠卵巢病理损伤。见图 1、表 4。图1 滋肾方对PCOS模型大鼠卵巢组织形态的影响(HE,50)64JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究表4 大鼠黄体、囊性卵泡数量统计情况(xs,n=10)个组别黄体数量囊性卵泡数量对照组6.501.220.380.48模型组4.251.20*6.882.26*滋肾方组5.75
21、0.834.251.09注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,P0.05。3.2.2 滋肾方对 PCOS 大鼠性激素和脂代谢水平影响与对照组比较,模型组小鼠 LH、LH/FSH 及T 水平升高,FSH 水平下降(P0.05);滋肾方治疗 14d 后,LH、LH/FSH 及 T 水平低于模型组(P0.05),FSH 水平高于模型组(P0.05)。脂代谢水平,与对照组比较,模型组小鼠 TG 及 LDL-C水平升高(P0.05),HDL-C 水平下降(P0.05),滋肾方组 TG 及 LDL-C 水平低于模型组(P0.05),HDL-C 水平高于模型组(P0.05)。见表 5、表 6。表5
22、大鼠FSH、LH、LH/FSH和T水平情况(xs,n=10)组别FSH/(UL-1)LH/(pgmL-1)LH/FSHT/(nmolL-1)对照组6.131.095.182.060.860.357.421.11模型组4.680.49*13.222.75*2.780.50*16.881.77*滋肾方组6.421.295.011.460.850.229.111.50注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,P0.05。表6 大鼠TG、HDL-C和LDL-C水平情况(xs,n=10)mmol/L组别TGHDL-CLDL-C对照组2.590.151.310.270.380.07模型组4.830.5
23、5*0.560.09*0.660.07*滋肾方组3.540.430.930.140.410.09注:与对照组比较,*P0.05;与模型组比较,P0.05。3.3 滋肾方干预 GCs 生物信息学分析为纳入患者的基线资料。如图 2A 所示,与PCOS 组比较,共有 26 个蛋白质在滋肾方组中的表达水平发生了改变。在这 26 个 DEP 中,14 个蛋白上调,12 个蛋白下调。2 个样本重复之间的表达谱一致,说明我们的蛋白组学数据适合进一步分析。其中,C/EBP 具有高度的差异性和连接性,是维持系统平衡和稳定的关键蛋白。GO 注释包括 3 种类型:生物过程、细胞成分和分子功能。排除未知的类别,代谢过
24、程(GO:0008152)和细胞过程(GO:0009987)是对照组和滋肾方组之间代表性最高的生物过程类别。结合(GO:0005488)和催化活性(GO:0003824)在分子功能类别中占主要比例,而细胞(GO:0005623)和细胞部分(GO:0044464)在各种细胞成分中的代表性最高。见图 2、表 7。表7 PCOS患者的人口学特征(xs,n=30)基线PCOS年龄/岁24.333.46初潮/岁13.201.25BMI/(kgm-2)24.682.36腰臀比0.770.03FSH/(mIUmL-1)5.951.68LH/(mIUmL-1)12.416.44LH/FSH2.560.68E2
25、/(pgmL-1)47.9545.88T/(nmolL-1)0.750.39PRL/(gL-1)10.635.16P/(mgL-1)0.610.42A.差异蛋白富集热图;B.差异蛋白GO富集分析。图2 滋肾方干预PCOS患者GCsITRAQ蛋白质组学研究3.4 差异蛋白体外验证结果与对照组比较,用 0.2%滋肾方处理 48h 后,KGN 增殖率最高(P0.05),见图 3A、表 8。凋亡数据表明,滋肾方可以减少 KGN 细胞的凋亡(P0.05),见图 3B、表 9。RT-qPCR 和 WesternBlot 结果显示,与对照组比较,滋肾方组 C/EBP基因及蛋白表达水平上升(P0.05),见图
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