血浆游离DNA含量和完整性.态变化在食管癌中的临床价值_马春芳.pdf
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1、目的 探讨食管癌病人血浆游离DNA(cf-DNA)的含量和完整性(以cf-DNA长片段ALU247与短片段ALU115含量的比值表示)在食管癌诊治中的临床意义。方法 选择2020年6月至2022年5月苏州市第九人民医院收治的50例食管癌病人、50例食管良性肿瘤病人、50例健康对照者为前瞻性研究的研究对象,分别纳入食管癌组、食管良性病变组以及健康对照组,用微量血液基因组提取试剂盒(Qiagen)提取血浆cf-DNA,并以实时荧光定量PCR法检测cf-DNA含量,收集其中25例食管癌病人术后血浆并检测 cf-DNA 含量,动态监测 cf-DNA 在术前术后的变化。检测食管癌病人糖类抗原 199(C
2、A199)、癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)含量,比较cf-DNA和肿瘤标志物在食管癌中的诊断价值。结果 食管癌组、良性病变组、健康对照组术前食管癌血浆 ALU115含量 4.30(2.06,8.36)g/L,1.98(1.38,3.02)g/L,1.63(0.87,2.66)g/L;ALU247含量1.40(0.91,4.10)g/L,0.63(0.37,1.27)g/L,0.26(0.15,0.43)g/L;cf-DNA 完整性 0.41(0.29,0.69),0.33(0.25,0.50),0.18(0.11,0.28)(均P0.05);ALU115 术前4.41(2.0
3、4,8.87)g/L,术后1.05(0.66,1.75)g/L 以及完整性 术前0.49(0.27,0.77),术后0.30(0.17,0.37)在术前术后相比差异有统计学意义(P0.05);在食管癌分期、分化程度、是否有远处转移上血浆cf-DNA差异有统计学意义(P0.05);相比传统肿瘤标志物,血浆cf-DNA的诊断效能更高,当ALU247含量取0.65 g/L时,受试者操作特征(ROC)曲线下面积最大,为0.95。结论 血浆cf-DNA检测在食管癌诊治、预后中有一定的临床价值。关键词:食管肿瘤;血浆游离DNA;糖类抗原199(CA199);癌胚抗原(CEA);鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)
4、Clinical value of dynamic changes of plasma cell free DNA content and integrity in esophageal carcinomaMA Chunfang,LI Xiangxiang,YANG HonglinAuthor Affiliation:Laboratory Department of Suzhou Ninth Peoples Hospital,Suzhou,Jiangsu 215000,ChinaAbstract:Objective To investigate the clinical significanc
5、e of plasma cell free DNA(cf-DNA)content and integrity in the diagnosis and treatment of esophageal cancer.Methods Fifty patients with esophageal cancer,50 patients with benign esophageal tumors,and 50 healthy controls admitted to the Suzhou Ninth Peoples Hospital from June 2020 to May 2022 were sel
6、ected as study subjects for the prospective study,and were included in the esophageal cancer group,the group with benign esophageal lesions,and the control group,respectively.A micro blood genome extraction kit(Qiagen)was used to extract cf-DNA,and real-time fluorescence quantitative PCR was utilize
7、d to evaluate the plasma cf-DNA content.The postoperative plasma of 25 esophageal cancer patients was collected,and the cf-DNA content was quantified,as well as the variations in cf-DNA before and after surgery,which were dynamically identified.At the same time,the levels of tumor markers carbohydra
8、te antigen 199(CA199),carcinoembryonic antigen(CEA)and squamous cell carcinoma antigen(SCC)were also examined in patients with esophageal cancer to compare the difference between the diagnostic significance of cf-DNA and tumor markers in esophageal cancer.Results Preoperative plasma ALU115 content i
9、n esophageal cancer 4.30(2.06,8.36)g/L,1.98(1.38,3.02)g/L,1.63(0.87,2.66)g/L;ALU247 content 1.40(0.91,4.10)g/L,0.63(0.37,1.27)g/L,and 0.26(0.15,0.43)g/L;and free DNA integrity 0.41(0.29,0.69),0.33(0.25,0.50),0.18(0.11,0.28)in the esophageal cancer group,benign lesion group and healthy control group,
10、showed statistically significant differences among the three groups(P0.05);The difference in ALU115 preoperative 4.41(2.04,8.87)g/L,postoperative 1.05(0.66,1.75)g/L as well as integrity preoperative 0.49(0.27,0.77),postoperative 0.30(0.17,0.37)was statistically significant when compared before and a
11、fter surgery(P0.05);Additionally,there were statistical differences in plasma cf-DNA according to the stage,level of differentiation,and existence of distant metastases in esophageal cancer(P 0.05).Compared with the conventional tumor markers,the diagnostic accuracy of plasma cf-DNA was greater,and
12、the area under the ROC curve was the maximum at 0.95 when the ALU247 level was taken as 0.65g/L.Conclusion Testing for plasma 临床医学引用本文:马春芳,李翔翔,杨鸿林.血浆游离DNA含量和完整性的动态变化在食管癌中的临床价值 J.安徽医药,2023,27(10):1986-1990.DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2023.10.017.1986网络首发时间:2023-09-05 14:57:56网络首发地址:https:/ 徽 医 药 Anh
13、ui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Oct,27(10)cf-DNA has certain clinical value for the diagnosis and therapy of esophageal cancer.Key words:Esophageal Neoplasms;Plasma cell free DNA;Carbohydrate antigen 199(CA199);Carcinoembryonic antigen(CEA);Squamous cell carcinoma antigen(SCC)食管癌是消化系统最常见的
14、恶性肿瘤之一,每年我国新发病例占全球的50以上。由于食管癌早期症状并不明显、加上内镜检查也不容易耐受,所以一般初诊都在预后较差的中晚期。因此,寻找简单、高效、无创的肿瘤指标对食管癌的辅助诊治至关重要。血液中的游离DNA(cf-DNA)是游离于细胞外的一种DNA,是目前研究的热点。某种程度上看,cf-DNA水平的变化和性质的改变能够反映原发肿瘤的特点1,为肿瘤的研究提供了更为便捷的方法。本次临床前瞻性研究即检测并探讨血浆cf-DNA在食管癌辅助诊断和预后中的临床意义。1资料与方法1.1一般资料选择2020年6月至2022年5月苏州市第九人民医院收治的50例食管癌病人、50例食管良性肿瘤病人、50
15、例健康对照者为研究对象,分别纳入食管癌组、食管良性病变组以及健康对照组。食管癌中男 18 例,女 32 例。年龄范围 3585岁,中位年龄 65 岁。按 UICC/AJCC 2017 年第八版食管癌 TNM 分期标准分期,其中 0期 3例、期 13例、期10例、期14例、期10例。食管良性病变组中男19例,女31例,年龄范围3685岁,中位年龄64岁。对照组中男18例,女32例,年龄范围3582岁,中位年龄66岁。纳入标准:内窥镜下活检诊断为食管癌;临床资料完整;均接受食管癌根治术治疗。排除标准:患有其他恶性肿瘤;患有慢性病、传染病等其他疾病;继发性食管癌或复发病。本研究经苏州市第九人民医院伦
16、理委员会审核批准(批号KY2022-042-01),病人或其近亲属知情同意。1.2血浆cf-DNA的收集和提取收集:取初次入院食管癌病人 EDTA 抗凝血 5 mL,1 600 g 离心 10 min;取上清4、2 850 g离心10 min,置于80 冰箱中备用。提取:按QIACube DNA试剂盒(同一批号)提取DNA,提取分装后置80 冰箱保存。1.3标准品的制备以及引物的设计和合成提取人基因组DNA作为标准品,由紫外分光光度测定仪测定其原始浓度,倍比稀释至 0.04、0.4、4、40、400 g/L。实 验 所 采 用 的 两 对 引 物(ALU115 和ALU2472)相关信息见表1
17、。1.4荧光定量PCR的体系及反应条件参照Real Master Mix(SYBR Green)说明书,采用 SYBR Green方法进行荧光定量 PCR,反应条件:94 预变性 1 min;94、30 s,62、20 s,72、30 s,共 45 次循环。见表2。荧光定量PCR仪(罗氏Light Cycler 480)上扩增提取的DNA,质粒标准品,阴性对照(双蒸水),同时建立阳性对照和空白对照。由罗氏PCR仪自带分析软件得出荧光阈值Ct值,建立标准浓度曲线。cf-DNA浓度根据标准曲线定量分析测得。同时熔解曲线无杂峰,保证了目的产物的纯度。样本结果取两复孔检测的均值。1.5统计学方法用 S
18、PSS 19.0进行数据分析,表示方法取中位数和四分位数间距(入选数据均不符合正态分布)。分别采用 Mann-Whitney U 检验和Kruskal-Wallis H 检验进行两组数据和多组数据之间的比较。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1标准曲线的建立成功构建浓度梯度的-actin 质粒标准品的扩增曲线。回归方程:Y=3.226 logX+18.79,R2=0.991,扩增效率E=1.021。2.2食管癌、食管良性病变、对照组血浆cf-DNA比较总体比较,ALU115、ALU247、完整性在三组之间比较差异有统计学意义(P0.001),见表3。2.3血浆cf-DNA在食管癌中的动
19、态变化收集其中25例食管癌病人根治手术术后3 d的血浆进行检测,显示ALU115以及完整性在食管癌病人术前术后之间的差异有统计学意义(P0.05),见表4。2.4血浆cf-DNA在入选食管癌临床病理参数之间的分布结果表明,ALU115、ALU247在食管癌有无远处转移上差异有统计学意义(P0.05);完整性在表1ALU基因引物序列引物ALU115ALU247长度/bp115247引物序列正向5-CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG-3反向5-CCCGAGTAGCTGGGATTACA-3正向5-GTGGCTCACGCCTGTAATC-3反向5-CAGGCTGGAGTGCAGTGG-3表2荧光
20、定量PCR反应体系反应体系1SYBR Green Real Master Mix200 nmol/L正向引物200 nmol/L反向引物双蒸水DNA模板总体积体积/L91172201987安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Oct,27(10)食管癌分化程度、分期上差异有统计学意义(P0.05)。见表5。2.5cf-DNA、肿瘤标志物在食管癌中的诊断效能对比对食管癌组血清及健康对照组血清中相关肿 瘤 标 志 物 糖 类 抗 原 199(CA199)、癌 胚 抗 原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)的含量进行采集检测。
21、整体分析,AUC曲线下面积以ALU247最大,为0.95;ALU247取0.65 g/L时,灵敏度0.84,特异度0.96。相应各指标的灵敏度、特异度见表6。3讨论1948年首次在人体外周血中发现游离核酸,然而很长一段时间以来,它的意义和重要性都不为人们所重视和研究。直至近年来,越来越多的研究投入到游离核酸和循环肿瘤细胞3-5等领域,关于其和自身免疫病,恶性肿瘤等疾病的相关性也得到了越来越广泛的探讨。其中游离核酸的研究主要聚焦于定量和表观遗传学的改变,包括 cf-DNA 的完整性、微卫星不稳定性、杂合性丢失(LOH)、甲基化以及基因突变等6-9。在外周血游离脱氧核糖核酸定量方面,不同的研究采用
22、了包括-actin10、GAPDH11等管家基因在表4食管癌25例根治术前后cf-DNA比较组别术前术后U值P值ALU115/(g/L)4.41(2.04,8.87)1.05(0.66,1.75)3.400.001ALU247/(g/L)1.41(0.91,4.54)0.23(0.12,0.55)1.380.168ALU247/ALU1150.49(0.27,0.77)0.30(0.17,0.37)5.950.001注:ALU115 为 115bp ALU 序列 cf-DNA 含量,ALU247 为 247bp ALU序列游离DNA含量,ALU247/ALU115为游离DNA的完整性。表3食管
23、癌、食管良性病变与健康对照组的ALU115、ALU247、ALU247/ALU115比较/M(P25,P75)分组健康 对照组良性病变食管癌H值P值例数505050ALU115/(g/L)1.63(0.87,2.66)1.98(1.38,3.02)4.30(2.06,8.36)32.340.001ALU247/(g/L)0.26(0.15,0.43)0.63(0.37,1.27)1.40(0.91,4.10)68.560.001ALU247/ALU1150.18(0.11,0.28)0.33(0.25,0.50)0.41(0.29,0.69)34.970.001注:ALU115为115bp A
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