布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化.pdf
《布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化.pdf(8页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、水学报(农业与生命科学版),2023,44(4):9 0-9 7.引文格式:顾明慧,范瑞洋,王道晨,等布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化J.扬州大学DOI:10.16872cnki.1671-4652.2023.04.012Jul.20232023年7 月Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)Vol.44 No.4第44卷第4期扬州大学学报(农业与生命科学版)布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化顾明慧,范瑞洋,王道晨,顾晨,于明浩,魏万红,杨生妹(扬州大学生物科
2、学与技术学院,江苏扬州2 2 50 0 9)摘要:纤维素在纤维素分解菌的作用下分解成可利用的物质,有利于改善环境污染和缓解能源危机。布氏田鼠是主要分布在我国内蒙古草原上的一种植食性动物,其盲肠微生物种类丰富。从布氏田鼠盲肠中筛选具有高效分解纤维素能力的菌株,并对筛选的菌株进行鉴定及纤维素酶的酶学特性分析。结果表明:刚果红染色法初筛出8 株具有分解纤维素能力的菌株,发酵法复筛出分解能力最强的菌株T1,形态学观察及分子生物学鉴定确定该菌株为枯草芽孢杆菌(Ba c i l l u s s u b t i l i s s t r a i n)。菌株T1以1.5%玉米粉作为碳源、1%蛋白陈作为氮源、接种
3、量5%时产纤维素酶量最高。该纤维素酶最适反应pH值4.8,最适反应温度40,最佳反应时间40 min,且具有一定的酸碱耐受性和热稳定性,这一研究为纤维素的开发利用提供理论依据。关键词:布氏田鼠;纤维素分解菌;分离与鉴定;酶学特性中图分类号:Q93文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 3)0 4-0 0 9 0-0 8Isolation and identification of cellulose-degrading bacteria from cecumof Brandts vole and optimization of celloluase producing c
4、onditionsGU Minghui,FAN Ruiyang,WANG Daochen,GU Chen,YU Minghao,WEI Wanhong,YANG Shengmei(College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:Cellulose is decomposed into usable substances under the action of cellulose-degrading bacteria,which isbeneficial to a
5、meliorate environmental pollution and alleviate energy crisis.Brandts vole is one kind of herbivorous mam-mals mainly distributed in Inner Mongolia steppe of China,and its cecum contains a large number of microbes.The pur-pose of this study was to screen strains with high cellulose-degrading activit
6、y from the cecum of Brandts vole,to identifythe selected strains and analyze the enzymatic characteristics of its cellulase.The results showed that 8 strains werescreened by Congo red staining method,and the strain T1 with the highest cellulase ability was screened by fermentationmethod.The strain w
7、as identified as Bacillus subtilis strain by morphological observation and molecular biology.StrainT1 had the highest enzyme activity when inoculated with 1.5%corn flour as carbon source and 1%peptone as nitrogensource.The optimum pH,temperature and time of the enzymatic reaction were 4.8,4o C and 4
8、0 min,respectively.Theenzyme had a certain acid-base tolerance and thermal stability.The above results provided a theoretical basis for the devel-opment and utilization of cellulose.KEY WORDS:Brandts vole;cellulose degrading bacteria;isolation and identification;enzymatic characteristics纤维素是自然界中数量最多
9、的可再生资源之一1。由于其特殊的晶体结构在自然条件下难以被收稿日期:2 0 2 1-0 6-2 0基金项目:国家自然科学基金资助项目(3197 1418)作者简介:顾明慧(1997 一),女,江苏盐城人,扬州大学博士研究生,主要从事动物肠道微生物研究。*通信作者,杨生妹,扬州大学教授、博导,主要从事动植物协同进化研究;E-mail:s m y a n g y z u.e d u.c n。团91顾明慧等:布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离其产条件优化第4期解,仅少量纤维素能被降解利用2 。纤维素酶是一组能将纤维素分子降解为纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的复合酶3。利用微生物产纤维素酶降解纤维素是一种
10、较有效的纤维素处理方法,该方法温和、产物产率高、无二次污染4。目前已从土壤5、堆肥6 、反台动物胃肠道7 等环境中分离出多株高产纤维素酶的菌株,但对布氏田鼠胃肠道纤维素分解菌的研究尚未见报道。布氏田鼠是主要分布在我国内蒙古草原上的一种植食性哺乳动物8-9,每只每天可食用约40 g鲜草10 ,是典型的盲肠发酵动物。Ye等11 研究表明布氏田鼠盲肠内微生物数量和种类复杂多样。鉴此,本研究以布氏田鼠盲肠内容物为材料,通过刚果红染色初筛、酶活力测定复筛等方法筛选出高酶活性纤维素分解菌株,并对菌株进行形态学及分子生物学鉴定,研究其酶学特性,为纤维素资源的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1
11、.1样品来源布氏田鼠捕捉于内蒙古锡林浩特草原,饲养于扬州大学生物科学技术学院实验动物房,并建立繁殖系。随机选10 0 日龄健康布氏田鼠雌雄各2 只作为研究对象。布氏田鼠饥饿12 h后行安乐死,随后解剖取出盲肠,放人无菌EP管中,于一8 0 冰箱中保存备用。1.1.2主要试剂蛋白陈、酵母提取物(济南金华峰辉生物科技公司);MgSO47H,O、Na C l、K,H PO 4、琼脂(国药集I化学试剂公司);刚果红、3,5-二硝基水杨酸(DNS)(上海生工生物工程公司)。1.1.3主要仪器及设备台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);电热恒温干燥箱(上海市实验仪器总厂);酶标仪(上海精密科学
12、仪器公司);高压蒸汽灭菌锅(日本Tomy公司);电子天平(上海精密科学仪器公司);PCR扩增仪(德国Christ-Elektronik公司);凝胶成像分析仪(BIO-RADLaboratories-Segrate)(美国Bio-Rad公司);恒温培养摇床(上海福玛实验仪器公司)等。1.2培养基与配方1)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基:CMC-Na10g,K,H PO 41.5g,蛋白陈5g,酵母粉5g,Na Cl 5g,M g SO 47Hz00.2g,琼脂16 g,纯化水10 0 0 mL。2)LB培养基:蛋白陈10 g,酵母5g,Na C l10 g,纯化水10 0 0 mL。3
13、)发酵产酶培养基:蛋白陈10 g,酵母5g,Na C l10 g,C M C-Na 10 g,纯化水10 0 0 mL1.3试验方法1.3.1纤维素分解菌初筛在超净工作台上将盲肠内容物挤入50 mL无菌生理盐水中,在摇床上震荡30 min。摇完后菌液混匀,梯度稀释至10-5级,取各浓度稀释肠液0.2 mL,分别涂布于CMC-Na平板上,于37 恒温培养箱中培养48 h,向培养皿中加人适量的1mgmL-1刚果红溶液,染色1h后弃去染液,再加人适量1molL-1NaC1溶液洗涤12 ,并测量水解圈的大小。1.3.2纤维素分解菌复筛将初筛菌株接种到液体发酵产酶培养基中,培养2 4h后离心取上清液,即
14、为粗酶液。以葡萄糖作为标准,采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂法测定纤维素酶活性,CMC-Na在纤维素酶的作用下,水解产生纤维二糖和葡萄糖等还原糖,还原糖能将DNS中的硝基还原成棕红色氨基化合物,在波长6 0 0 nm处测定吸光度D值,吸光度与酶活性呈正比。纤维素酶活性定义:以每毫升粗酶液每分钟产生1mg葡萄糖所需的酶量作为1个酶活性单位(UmL-1)。1.3.3菌株鉴定1)形态学鉴定:经初筛、复筛出1株纤维素酶活性最高的菌株T1,观察菌落的形态特征,并通过92第44卷扬州大学学报生命科学版)革兰染色观察菌体的染色特征1312)分子生物学鉴定:菌株T1培养过夜后用细菌基因组提取试剂盒提取D
15、NA,PCR 反应的引物为细菌通用引物,PCR反应体系体积为2 5L,反应条件见文献14。测序由上海生工生物工程公司完成。将测序结果在GenBank数据库中用BLAST比对获得相似性高的序列。利用MEGA6.0构建系统进化树,根据菌株间的亲缘关系确定菌株的种属。1.3.4菌株生长曲线将菌株T1接种到LB培养基中,培养至D600m值为1.0,得种子液。按1%种子液接人50 mL新配制的LB培养基中,37 摇床培养,每4h用酶标仪测1次D600nm值,直至6 0 h。1.3.5产酶条件优化将种子液接人发酵培养基中,依次优化培养基中碳源(高梁、玉米、大豆、羧甲基纤维素钠、水稻、小麦)、氮源(蛋白陈、
16、硫酸铵、硝酸铵、明胶)的种类和浓度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)以及接种量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%),37、16 0 r min-1振荡培养2 4h,将菌液在上述确定的最佳条件下进行纤维素酶活性测定,试验重复3次,结果取平均值。1.3.6纤维素酶的酶学特性研究1)酶反应最适pH:将1.0%CMC-Na的底物分别溶于pH3.07.0 的缓冲液中,40 反应30min后测定该纤维素酶活性,试验重复3次,结果取平均值,最终确定纤维素酶反应的最适pH值。2)酶的酸碱稳定性:将pH4.08.0 缓冲液与粗酶液按同等量混匀,40 水浴中保温1h,在最适pH反应条件下,测定相
17、对纤维素酶活性,试验重复3次,结果取平均值,并评价酶的酸碱稳定性。3)酶反应最适温度:将粗酶液分别置于不同温度(40、50、6 0、7 0 和8 0)反应30 min,测定该纤维素酶活性,试验重复3次,结果取平均值,最终确定纤维素酶反应的最适温度。4)酶的热稳定性:将粗酶液分别在30、40、50、6 0 和7 0 的水浴中保温1h,在最适温度和最适pH下测定相对酶活性,试验重复3次,结果取平均值,并评价该酶的热稳定性。5)最适反应时间:将粗酶液与CMC-Na底物在最适pH及最适温度条件下分别反应10、2 0、30、40和50 min,测定不同反应时间纤维素酶活性,确定纤维素酶反应的最佳时间。2
18、结果与分析2.1纤维素分解菌株的筛选在CMC-Na选择培养基上挑取菌落形态不同的菌株共8 株,经纯化培养,利用刚果红染色后菌落周围可见清晰的透明水解圈。将获得的菌株进行摇瓶发酵复筛,筛选结果见表1。最终选取纤维素酶活性最高的菌株T1用于酶学特性及产酶条件的探究。2.2菌株T1的鉴定2.2.1菌株T1的形态学鉴定经观察表明,菌株T1在固体培养基上扁平,表面褶皱,形成灰白色不透明的菌落表1纤维素分解菌的分离筛选Tab.1Isolation and screening of cellulose-degrading bacteria菌种水解圈直径/mm菌株直径/mm酶活性/UmL-1D/dstrain
19、sdistinct zone Dcolony zone denzymeactivitiyT123171.357.95T221141.507.72T315101.504.07T41782.104.37T525161.563.66T6541.253.20T7431.304.13T813111.184.05(图1.A)。经革兰染色,菌株T1为革兰阳性杆状菌,有芽孢(图1.B)2.2.2菌株T1的分子生物学鉴定测序结果显示,该纤维素分解菌T1的16 SrRNA基因序列长为137 4bp左右。序列同源性分析显示,菌株T1与芽孢杆菌属细菌的16 SrRNA序列相似性在99%以上。系统进化树分析显示,该菌株
20、与Bacillus subtilisstrain亲缘关系最近(图2)。综合该菌株的菌落形态、生化特性和分子生物学鉴定结果,确定获得的纤维素分解菌T1为枯草芽孢杆菌。向93顾明慧等:布氏田鼠盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及其产酶条件优化第4期2.3菌株T1的生长特性图3为菌株T1的生长规律,当发酵培养416h时,菌株T1进人对数生长期;培养1648 h 时处于缓慢增长期;40 h后进入衰退期。2.4菌株T1产纤维素酶条件的初步优化2.4.1碳源种类及浓度对菌株酶活性的影由图4.A可知,菌株T1可利用高梁、玉米、大豆、水稻、小麦及CMC-Na等碳源,但以玉米粉作为碳源时,酶活性最高(8.83UmL-
21、1),以小麦为碳源时,酶活性AB图1首菌株T1的菌落形态特征及革兰染色Fig.1Morphology characteristic and gram staining of strain T1最低(5.34UmL-1)。由于玉米粉来源广,价格低廉,因此选择玉米粉作为最佳碳源。由图5.B可知,当玉米粉浓度为1.5%时,酶活性最高(9.48 UmL-1),随着浓度的上升,酶活性降低。因此选择浓度为1.5%的玉米粉作为最佳碳源进行后续研究。相对遗传距离relativegeneticdistance85-MG825090.1 Uncultured Bacillus sp.clone BYCDW4a 1
22、6S riosomal RNA gene partial sequence0.000.538MH362700.1 Bacillus subtilis strain ZGL14 ribosomal RNA gene partial sequence21KM365462.1 Bacillus subtilis strain CICC 10366 16S ribosomal RNA gene partial sequence7-MN4426081 Bacillus subtilis subsp spizizenii strain JS-4 ribosomal RNA gene partial seq
23、uence26-MK070084.1 Bacillus velezensis strain A20102 16S ribosomal RNA gene partial sequenceMH819693.1 Bacillus subtilis strain TT207 16S ribosomal RNA gene partial sequence34MK311321.1 Bacillus strain Ull 16S ribosomal RNA gene partial sequence82-MK736l131 Bacillus sp.(in:Bacteria)strain 6051 16S r
24、ibosomal RNA gene partial sequenceMT3721491 Bacillus subtilis subsp spizizenii strain YEBBR3 16S ribosomal RNA gene partial sequence40,KC121041.1 Bacillus JN15 16S ribosomal RNA gene partial sequence6-KT588643.1 Bacillus subtilis subsp NJ1 16S ribosomal RNA gene partial sequence24MH518191.1 Bacillus
25、 sp.(in:Bacteria)strain CLC-F7 16S ribosomal RNA gene partial sequence29MK618597.1 Bacillus tequilensis strain CE12 16S ribosomal RNA gene partial sequence-T163-JQ9047141 Bacillus subtilis strain DHC03 16S ribosomal RNA gene partial sequence图2 菌株T116SrRNA基因序列的系统发育树Fig.21Phylogenetic tree of strain T
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 田鼠 盲肠 纤维素 分解 分离 鉴定 及其 条件 优化
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。