一种特殊虫草与冬虫夏草的表...特征比较分析及鉴别方法研究_张文娟.pdf
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1、中国现代中药 Modern Chinese Medicine ISSN 1673-4890,CN 11-5442/R 中国现代中药网络首发论文中国现代中药网络首发论文 题目:一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和DNA条形码特征比较分析及鉴别方法研究 作者:张文娟,李明华,程显隆,段庆梓,魏锋,华桦,赵军宁,马双成 DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.20230117002 网络首发日期:2023-08-10 引用格式:张文娟,李明华,程显隆,段庆梓,魏锋,华桦,赵军宁,马双成一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和 DNA 条形码特征比较分析及鉴别方法研究J/OL中国现代中药.http
2、s:/doi.org/10.13313/j.issn.1673-4890.20230117002 网络首发网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶段。录用定稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合出版管理条例和期刊出版管理规定的有关规定;学术研究成果具有创新性、科学性和先进性,符合编辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其
3、他侵权行为;稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、出版的技术标准,正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容,只可基于编辑规范进行少量文字的修改。出版确认出版确认:纸质期刊编辑部通过与中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有限公司签约,在中国学术期刊(网络版)出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为中国学术期刊(网络版)是国家新闻出版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN 2096-41
4、88,CN 11-6037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首发论文视为正式出版。基金项目国家“重大新药创制”科技重大专项(2014ZX0930437001);国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室项目(2022GSMPA-KL01);国家药品监督管理局中药质量研究与评价重点实验室“常见与重要中药材及饮片DNA分子鉴定研究”项目(NIFDC-TCM2021-036-YJ01)*通信作者:赵军宁,研究员,研究方向:药品监管科学,中药药理及转化中医学研究,E-mail:jn_Z;马双成,研究员,研究方向:中药质量控制与评价,E-mail: 一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和 DNA条形码特征
5、比较分析及鉴别方法研究 张文娟1,李明华1,程显隆1,段庆梓2,魏锋1,华桦3,4,赵军宁3,4*,马双成1*1.中国食品药品检定研究院,北京 102629;2.成都市食品检验研究院,四川 成都 611135;3.四川省中医药转化医学中心,四川 成都 610041;4.四川省中医药科学院,四川 成都 610041 摘要 目的:通过对子座和虫体部分进行表型与 DNA 条形码序列分析,探讨一种发现于四川的特殊冬虫夏草(以下简称特殊虫草)与常见冬虫夏草的区别。方法:体视显微镜观察虫草样品的外部特征;聚合酶链式反应(PCR)扩增得到真菌部位内转录间隔区(ITS)序列和宿主蝙蝠蛾昆虫的细胞色素氧化酶 I
6、(CO I)序列;利用CodonCode Aligner 和 MEGA 软件进行序列分析,建立 Neighbor-Joining(NJ)系统进化树;对 ITS 序列进行进行限制性内切酶图谱分析,寻找具有鉴别意义的酶切位点,并通过聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴别进行验证。结果:特殊虫草与常见冬虫夏草相比,虫体头部的颜色明显不同;子座真菌的 ITS 序列存在(7/562)个差异位点,虫体 CO I 序列存在(56/659)个差异位点,基于 ITS 序列及 CO I 序列的 NJ树分析均显示,二者不能聚为一支;在二者差异区域,冬虫夏草存在 1 个 Xho I 的酶切位点,
7、因此其 ITS 序列的 PCR 产物可被限制性内切酶Xho I 切割为 2 个片段,特殊虫草不能被 Xho I 切割,所以酶切前后的 PCR 产物在琼脂糖凝胶图上没有变化,通过该方法可对二者进行鉴别。结论:首次发现了一种特殊虫草,其与常见冬虫夏草的真菌子座和宿主蝙蝠蛾昆虫部分均有明显不同,为鉴别二者提供了有效方法。关键词 冬虫夏草;限制性内切酶;内转录间隔区;细胞色素氧化酶I 中图分类号 R282 文献标识码 A doi:10.13313/j.issn.16734890.20230117002 Comparative Study on Phenotype and DNA Barcode Cha
8、racteristics Between Special and Typical Ophionocordyceps sinensis ZHANG Wen-juan1,LI Ming-hua1,CHENG Xian-long1,DUAN Qing-zi2,WEI Feng1,HUA Hua3,4,ZHAO Jun-ning3,4*,MA Shuang-cheng1*1.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 102629,China;2.Chengdu Institute of Food Inspection,Chengdu 6
9、11135,China;3.Sichuan Institute for Translational Chinese Medicine,Chengdu 610041,China;4.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences,Chengdu 610041,China Abstract Objective:To analyze the differences between the special Ophiocordyceps sinensis found in Sichuan Province and the typical Ophiocordyce
10、ps sinensis based on the phenotype and DNA barcode sequence analysis of the stroma and host insect.Methods:The morphological characteristics were observed by the stereomicroscope.The internal transcribed spacer(ITS)sequence and the cytochrome oxidase I(CO I)sequence of the host insect were amplified
11、 by polymerase chain reaction(PCR).CodonCode Aligner and MEGA software were used for sequence analysis to establish Neighbor-Joining(NJ)phylogenetic tree.The restriction enzyme map of the ITS sequence was analyzed to find out the restriction sites of ITS sequences,and the identification was verified
12、 by PCR-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results:The color of the head of the host insects was apparently different between the typical Ophiocordyceps sinensis and the special one.There are 7/562 different sites within the ITS sequence of the fungus and 56/659 within the CO I seque
13、nce of the insects.The N-J tree based on ITS and CO I showed that the typical Ophiocordyceps sinensis and the special one cannot be clustered as an individual branch separately.In the different regions of Ophiocordyceps sinensis,there was one Xho I site,so the PCR products of the ITS sequence could
14、be cut into two fragments by the restrictive enzyme XhoI.Special Ophiocordyceps sinensis cannot be cut by Xho I,so the PCR products before and after enzyme digestion did not change on the agarose gel map,and the two could be identified by this method.Conclusion:A special Ophiocordyceps sinensis was
15、found for the first time,which was obviously different from the common Ophiocordyceps sinensis fungus and host insect,which provided an effective method for identifying the two.Keywords Ophiocordyceps sinensis;restrictive enzyme;internal transcribed spacer(ITS);cytochrome oxidase subunit I(CO I)网络首发
16、时间:2023-08-10 14:33:48网络首发地址:https:/ Ophiocordyceps sinensis(BerK.)Sacc 是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体,主要分布于 32005000 m 高寒地区的高山草甸和峡谷,为贵细传统中药材1-4。由于近年来过度采挖,其野生资源急剧减少,市场价格畸高,其他外观相似的虫草冒充冬虫夏草的现象比较普遍,常见伪品一般来源于虫草属,如古尼虫草、亚香棒虫草等。伪品的有效性及安全性尚缺乏全面深入研究,因此有必要建立相应的真伪鉴别方法5-9。基于 DNA 的分析方法客观准确,目前被广泛用于虫草和其他中药材的鉴定和真伪鉴别中。
17、虫草一般由真菌和蝙蝠蛾幼虫 2 部分组成,因此相关的鉴别方法研究也多基于这 2 个部分的不同。真菌的DNA 分析多基于内转录间隔区(ITS)10-13,而蝙蝠蛾幼虫则多基于虫体的线粒体基因细胞色素氧化酶 I(CO I)7,14。可以采用 DNA条形码鉴定法对虫草进行鉴定或者鉴别,分析不同虫草的亲缘关系等;或者采用聚合酶链式反应(PCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴别法,通过设计专属性引物或者依靠专属性限制性内切酶位点,达到鉴别的目的。本课题组发现了一种产自四川的特殊虫草,外观跟冬虫夏草非常相似,通常被当作冬虫夏草使用,但是其微性状、真菌 ITS 序列及虫体 CO I 序
18、列与冬虫夏草都具有明显的区别,因此认为不应盲目将该虫草当作冬虫夏草使用,需要与冬虫夏草进行鉴别。本研究建立了基于 Xho I 限制性内切酶的 PCR-RFLP 鉴别法,可以实现冬虫夏草与该特殊虫草的客观准确鉴别,从而为提升冬虫夏草质量控制水平提供有效手段。1 材料 1.1 样品 虫草样品经中国食品药品检定研究院标本馆张继主任药师鉴定,样品详细信息见表 1。表 1 虫草样品信息 名称 编号 产地 冬虫夏草 Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc CS1 西藏那曲 CS2 西藏那曲 CS3 四川康定雅家梗 CS4 四川康定雅家梗 CS5 青海 CS6 青海 CS7 青海 CS8
19、 青海玉树 CS9 四川甘孜 CS10 西藏加查 CS11 甘肃甘南 CS12 西藏 CC2 四川阿坝 CC4 四川阿坝 CC7 四川甘孜 特殊虫草 CC3 四川甘孜 CC5 四川甘孜 CC6 四川阿坝 新疆虫草 Cordyceps gracilis(Grev.)Dur.et Mont.WP0301、WP0302、WP0401、WP0402 西藏 古尼虫草 Cordyceps gunnii(Berk.)Berk.WP6-P3、WP6-P6 西藏 戴氏虫草 Cordyceps taii Z.Q.Liang et A.Y.Liu CGR1、CGR2 新疆 凉山虫草 Cordyceps liangs
20、hanensis Zang,Liu et Hu CGN1、CGN2 贵州 新疆虫草 Cordyceps gracilis(Grev.)Dur.et Mont.CT1、CT2 贵州 古尼虫草 Cordyceps gunnii(Berk.)Berk.LS 四川 1.2 仪器 VERITI 型聚合酶链式反应(PCR)仪(Thermo Fisher 公司);AB135-S 型分析天平(Mettler-Toledo 公司);EPS-301 型电泳仪(Amersham 公司);DMC4500 型体视荧光显微镜(Leica 公司);Gel Doc XR+型全自动凝胶成像系统(Bio-Rad 公司);MM40
21、0 型球磨仪(Retsch 公司)。1.3 试剂 快捷型植物基因组提取试剂盒(批号:DP321,天根生化科技有限公司);Ex Taq(批号:DRR100B,TaKaRa 公司);dNTP Mixture(批号:N0447,Biolabs 公司);XhoI(批号:R0146,Biolabs公 司);GelRed(批 号:41003,Biotium公 司);ITS引 物(上 游:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3,下游:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,深圳华大基因科技有限公司)。2 方法 2.1 样品处理与 DNA 提取 分别取样品的子座和虫体部分,用酒精棉球将
22、表面擦拭干净,晾干;用球磨仪磨成极细粉末,称取粉末样品约 30 mg 备用。基因组 DNA 提取按照试剂盒说明书进行操作。2.2 PCR 扩增及序列分析 PCR 反应条件:预变性 94,5 min;94、30 s,52、30 s,72、30 s(35个循环);最后延伸 72、5 min。PCR 反应体系 25 L:DNA 模板 1 L,上下游引物各 0.2 L,Taq DNA 聚合酶 0.2 L,dNTP(10 mmolL1)0.6 L,反应缓冲液 2.5 L,灭菌超纯水 20.3 L。PCR 样品送深圳华大基因科技有限公司进行 Sanger 法测序。采用 CodonCode Aligner
23、进行序列拼接、剪切和限制性内切酶位点分析;采用 MEGA 5.0 进行多序列比对分析,构建邻接(NJ)系统进化树。2.3 XhoI 酶切反应 反应体系为 20 L,包括 PCR 产物 10 L、XhoI 0.5 L、反应缓冲液 2 L、灭菌去离子水(ddH2O)7.5 L。反应条件为 37、15 min。2.4 琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像 使用 1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,电压 5 Vcm1,约 40 min;电泳结束后使用凝胶成像仪拍照并保存结果。3 结果 3.1 冬虫夏草和特殊虫草的性状特征比较 2 种虫草均由子座部分和虫体部分组成。与冬虫夏草相比,特殊虫草的子座部分较短,虫体较小(图 1
24、)。通过体视显微镜观察,特殊虫草头部的颜色与冬虫夏草明显不同,冬虫夏草为黄褐色(图2A),特殊虫草为红褐色(图 2B),提示二者的宿主蝙蝠蛾昆虫存在不同。注:1.特殊虫草;2.冬虫夏草。图 1 特殊虫草与冬虫夏草的性状特征 注:A.冬虫夏草;B.特殊虫草。图 2 体式显微镜成像显示冬虫夏草和特殊虫草头部颜色 3.2 冬虫夏草和特殊虫草寄生真菌的 ITS 序列差异 通过对寄生真菌的 ITS 序列进行比对分析,冬虫夏草和特殊虫草存在 7 个差异位点(总长 562 bp)(图 3A);基于 ITS 序列的 NJ 系统进化树分析显示,冬虫夏草与特殊虫草各聚为一支;二者汇聚后又与伪品虫草聚为一支(图 3
25、B)。表明特殊虫草的寄生真菌与冬虫夏草亲缘关系较近,与常见伪品关系较远。注:注:A.多序列比对分析 ITS 差异位点;B.基于 ITS 的 NJ 系统进化树分析。图 3 冬虫夏草和特殊虫草的真菌 ITS 序列分析。3.3 冬虫夏草和特殊虫草宿主 CO I 序列差异 对宿主蝙蝠蛾幼虫的 CO I 序列进行比对分析,冬虫夏草和特殊虫草宿主的 CO I 序列存在 56 个差异位点(总长 659 bp,图 4A);基于 CO I 序列的 NJ 系统进化树分析显示,特殊虫草与常见伪品虫草首先聚为一支,然后再与冬虫夏草汇聚,表明特殊虫草的宿主蝙蝠蛾昆虫与一些常见伪品具有更近的亲缘关系(图 4B)。CC2
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