一株同时携带bla_(CT...内志贺菌耐药基因及质粒分析_刘康康.pdf
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1、*耐药监测*一株同时携带blaCTX-M-14和blaCTX-M-15基因的多重耐药宋内志贺菌耐药基因及质粒分析刘康康,李春晓摘要:目的对 1 株同时耐头孢菌素和阿奇霉素的多重耐药宋内志贺菌进行全基因组测序分析,明确其携带的耐药基因和质粒特征。方法通过对 2011 年上海市的 60 株宋内志贺菌进行抗菌药物敏感性分析,筛选出 1 株同时耐头孢菌素和阿奇霉素的菌株 Sh11sh529,使用二代和纳米孔测序技术获得其基因组序列,分析基因组的耐药基因、质粒、可移动遗传元件等。结果Sh11sh529 基因组中检测到了 11 个耐药基因以及 gyrA 基因喹诺酮耐药决定区(QRDR)的突变位点 gyrA
2、-S83L,耐药基因包括 2 种 CTX-M 型超广谱 内酰胺酶(ESBL)基因 blaCTX-M-14和 blaCTX-M-15,其中 blaCTX-M-14、mphA、aac(3)-IId、dfrA17、aadA5、sul1 和 qacEdelta 基因由 1 个 IncB/O/K/Z 型质粒 pSh11sh529-2 携带,blaCTX-M-14上游有 1 个 ISEcp1 插入子,mphA 上游有 1 个IS26 插入子。而 blaCTX-M-15由 IncFII 型质粒 pSh11sh529-3 携带,在其上游有 1 个 ISEcp1 插入子。该菌株表现出多重耐药性,对头孢菌素类、大
3、环内酯类、氨基糖苷类、磺胺类、青霉素类等 5 类抗菌药物中的 9 种耐药。结论应当加强对多重耐药菌株以及同时携带多个类型 ESBL 菌株的监测和研究,以制定策略减少其流行和传播。关键词:宋内志贺菌;多耐药菌株;超广谱 内酰胺酶;质粒;基因组测序中图分类号:R211;R378文献标志码:A文章编号:10039961(2023)05057407Resistancegenesandplasmidsofamulti-drugresistantShigellasonneistraincarryingbothblaCTX-M-14andblaCTX-M-15genesLiu Kangkang,Li Chu
4、nxiao.Academy of Military Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Li Chunxiao,Email:Abstract:ObjectiveToanalyzethewholegenomesequencingofamulti-drugresistantShigella sonneistrainresistanttobothcephalosporinandazithromycinandidentifyt
5、hecharacteristicsofitsresistancegenesandplasmids.MethodsAcephalosporinandazithromycinresistantS.sonneistrain(Sh11sh529)wasscreenedbyanalyzingtheantibioticsusceptibilityof60S.sonneistrainscollectedfromShanghaiin2011,andgenomesequenceofthestrainwasobtainedbysecond-generationsequencingandnanoporesequen
6、cingtechnology.Thedrugresistancegenes,plasmidsandgeneticmobileelementswereanalyzed.ResultsElevenresistancegenesandgyrA-S83Lmutationsitesinquinoloneresistancedeterminingregion(QRDR)ofgyrAgeneweredetectedingenomeoftheSh11sh529strain.Theresistancegenesincludedtwoextendedspectrum-lactamases(ESBLs)genesb
7、laCTX-M-14andblaCTX-M-15.TheblaCTX-M-14,mphA,aac(3)-IId,dfrA17,aadA5,sul1andqacEdeltageneswerecarriedbyanIncB/O/K/Zplasmid(pSh11sh529-2).TherewasanISEcp1insertinupstreamofblaCTX-M-14,anIS26insertinupstreamofmphA.TheblaCTX-M-15genewascarriedbyanIncFIIplasmid(pSh11sh529-3),andtherewasanISEcp1insertinu
8、pstreamofblaCTX-M-15.Thestrainwasresistantto9antibioticsof5classes,includingcephalosporins,macrolides,aminoglycosides,sulfonamides,andpenicillins.ConclusionItisnecessarytostrengthenthesurveillanceandresearchofmulti-drugresistantstrainsandstrainscarryingmultipletypesofESBLforthedevelopmentofstrategie
9、storeducetheprevalenceandspreadofmulti-drugresistantstrains.Keywords:Shigella sonnei;Multi-drugresistantstrain;Extendedspectrum-lactamase;Plasmid;Wholegenomesequencing志贺菌是引起细菌性痢疾的革兰阴性菌,每年全球约有 1.88 亿人感染,约 16 万例死亡,而且死亡病例主要为婴幼儿1。宋内志贺菌主要是发达国家常见的志贺菌病的病原血清群,然而近些年在包括中国的一些发展中国家,其流行率已经超过福氏志贺菌23。由于获得了相关耐药基因,宋
10、内志贺菌对传统抗菌药物,如氨苄青霉素、磺胺甲基异恶唑等的耐药率处于较高水平2,世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)将环丙沙星列为志贺菌病的一线治疗药物,而将头孢曲松、阿奇霉素列为对环丙沙星耐药的多重耐药志贺菌的替代治疗药物4。位 于 gyrA、parC 等 基 因 喹 诺 酮 耐 药 决 定 区(quinoloneresistancedeterminingregion,QRDR)的作者单位:军事科学院军事医学研究院,北京100850作者简介:刘康康,男,河南省周口市人,硕士研究生在读,主要从事病原菌基因组进化研究,Email:通信作者:李春晓,Tel:0106
11、6948592;Email:收稿日期:20230213网络出版日期:20230505574疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202302130035碱基突变会降低菌株对环丙沙星的敏感性。而这些突变在宋内志贺菌主要流行分支的菌株中已经普遍存在,致使环丙沙星的治疗作用降低2。头孢菌素、阿奇霉素等替代抗菌药物成为临床治疗环丙沙星耐药菌株的有效手段,然而也出现了对替代抗菌药物耐药的菌株,获得 blaCTX-M基因使菌株对头孢类抗菌药物耐药,早在 2001
12、 年,Pai 等5就报道了能够表达 CTX-M-14 型 超 广 谱 内 酰 胺 酶(Extendedspectrum-lactamases,ESBLs)的 宋 内 志 贺 菌。2018 年的一项研究中,我国新疆维吾尔自治区携带blaCTX-M基因的宋内志贺菌分离率达 19.4%6。2008 年,Boumghar-Bourtchai 等7报道了对大环内酯类耐药的宋内志贺菌,并且指出获得 mphA 基因使宋内志贺菌对阿奇霉素耐药,2017 年有研究指出我国浙江地区携带 mphA 基因的志贺菌分离率达11.22%。而 2019 年董念8的研究指出,头孢菌素和阿奇霉素共耐药宋内志贺菌的分离率达 11
13、.5%。可见对替代抗菌药物耐药的宋内志贺菌已经在国内流行,更值得引起注意的是,这些菌株中还包含多耐药,乃至泛耐药特征,在国内外引起暴发910。近年来,多重耐药志贺菌成为主要流行菌株,在全球不同地区广泛流行和传播,甚至出现了同时对一线治疗药物环丙沙星以及替代抗菌药物头孢曲松和阿奇霉素耐药的志贺菌,而且在多个国家和地区引起了暴发,给临床治疗和公共卫生防控工作带来了极大困难和挑战。本研究对头孢菌素和阿奇霉素共耐药的菌株进行筛选,对发现的 1 株同时耐头孢菌素和阿奇霉素的多重耐药宋内志贺菌进行了全基因组测序,并对该菌的耐药基因以及质粒的特征进行分析。1材料与方法1.1菌株来源及药物敏感性试验本研究对
14、2011 年上海市的 60 株宋内志贺菌进行头孢菌素和阿奇霉素共同耐药菌株的筛选试验。使用法国梅里埃公司的 API20E 试剂和日本生研公司的商业抗血清试剂进行了生化试验和血清学复核鉴定。使用肉汤稀释法测试妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、亚胺培南、头孢曲松、头孢他啶、头孢西丁、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢唑啉、诺氟沙星、左氧氟沙星、甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲恶唑、阿奇霉素、氨曲南、呋喃妥因、替卡西林、哌拉西林、氨苄西林、氯霉素、四环素、替卡西林/克拉维酸 12 类共 22 种抗菌药物的敏感性试验,依 据 临 床 和 实 验 室 标 准 化 协 会(Clinical andLaboratoryStandar
15、dsInstitute,CLSI)指南(2021 版)最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)判读折点(耐药:R;中介:I;敏感:S)11。阿奇霉素的 MIC 值用手工微量肉汤稀释法进行测定,判读范围为 4256g/mL,MIC32g/mL 判读为阿奇霉素耐药。其余抗菌药物使用 ThermoFisherScientific 公司的 CMV3AGNF 板测试 MIC。1.2基因组测序使用德国凯杰生物公司的QIAampDNAMiniKit 提取基因组 DNA,用美国Illumina 公司 IlluminaMiseq 二代测序平台和英国牛津纳米孔公司的 G
16、ridIOn 三代测序平台对菌株进行全基因组测序,并使用测序平台自带的流程得到序列信息的下机数据。使用FastQC(https:/ GC 含量,使用 Trimmomaticv0.3912软件对二代下机数据进行质量控制,使用 Filtlong(https:/ 的三代测序数据,去除低质量的 reads 和接头序列,得到高质量的测序数据。使用 Unicyclerv0.4.813混合组装二代与三代测序数据得到菌株的染色体和质粒序列。对基因组序列的基因注释使用 Prokka14软件完成。1.3质粒分析使用 Plasflowv1.115软件预测基因组组装序列中的质粒序列。将预测为质粒的序列在美国国家生物技
17、术信息中心(NationalCenterforBiotechnology Information,NCBI)网站进行在线BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)比对,挑选与本研究质粒序列相似的质粒进行比较分析。使用本地化的 BLASTv2.12.016软件将预测为质粒的序列与 PlasmidFinder17数据库进行比对,确定质粒复制子的类型。质粒比较圈图使用BRIG18软件绘制。1.4耐药基因分析耐药基因的分析参考本地化的v3.13 版本的综合抗生素耐药性数据库(ComprehensiveAntibioticResistanceDatabase,CARD),并
18、使用数据库对应的本地化软件 RGIv5.1.119(ResistanceGeneIdentifier)确定基因组数据中的耐药基因携带情况和喹诺酮类药物耐药相关的突变位点,序列类型选择为低覆盖度的 contigs,结果保留序列覆盖度95%同时相似度95%的耐药基因。1.5可移动遗传元件分析使用 BLAST 软件将染色体和质粒序列分别与 INTEGRALL20整合子数据库和 ISfinder21插入子数据库进行比对,确定整合子以及插入子的类型及其在序列中的位置信息。2结果2.1菌株药物敏感性发现 1 株同时对头孢菌素和阿奇霉素耐药的菌株 Sh11sh529,该菌株对头孢曲松、头孢哌酮、头孢唑啉和阿
19、奇霉素皆耐药,对头孢他啶的 MIC 值为 16g/mL,为中度耐药;对氨基糖疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5575www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202302130035苷类(妥布霉素、庆大霉素)、甲氧苄胺嘧啶/磺胺甲基异恶唑、青霉素类(替卡西林、哌拉西林、氨苄西林)耐药,对氨曲南的 MIC 值为 16g/mL,对替卡西林/克拉维酸的 MIC 值为 32/264/2g/mL,均为中度耐药。对阿米卡星、亚胺培南、头孢西丁、头孢吡肟、氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、左氧氟沙星)、呋喃妥
20、因、氯霉素、四环素等药物敏感(表 1)。2.2测序结果对菌株进行二代全基因组测序,获得了双端测序下机数据共 2.66GB,单端测序数据2GB,平均测序深度分别为 250和 240,经质量控制去除低质量 reads 后,分别获得高质量数据2.6GB 和 0.8GB,测序数据 GC 含量分别为50.23%和 49.14%,对高质量数据组装后得到菌株的基因组大小为 4.9MB,其中共包含 4689 个编码区序列(CodingSequence,CDS)以及 86 个 tRNA。2.3质粒分析Plasflow 预测两条序列为质粒序列:pSh11sh529-2(112374bp),pSh11sh529-3
21、(64606bp),通过将质粒 pSh11sh529-2 和 pSh11sh529-3 与 NCBI网站在线 BLAST 比对,结果显示,pSh11sh529-2与国内一起宋内志贺菌暴发菌株中发现的质粒pSH287-2(序列号:MG299151)以及日本 1 株大肠埃希菌的质粒 pBEC1-S17-ESBL-07_1(序列号:AP022296)相 似 度 较 高,这 3 个 质 粒 均 属 于IncB/O/K/Z 型;pSh11sh529-3 质粒与一个福氏志贺菌的质粒 p002(序列号:CP085204)相似度较高。分析发现 pSh11sh529-2 仅在 8917689943bp 的位置比
22、 pSH287-2 质粒多了一段 IS1 插入子序列,这两个质粒相比于 pBEC1-S17-ESBL-07_1 在 4755549363bp 的位置多了一个 aac(3)-IId 基因和一个ISVsa5 插入子,在 5217456123bp 的位置多了一段 intI1 整 合 子 和 dfrA17 aadA5 qacEdelta sul1基因盒(图 1)。而相比于 p002 质粒,pSh11sh529-3在6140062926bp 的位置获得了一段含有blaCTX-M-15基因和 ISEcp1 插入子的序列,在 4729849804bp的位置多携带了 3 个注释为假定蛋白(hypothetic
23、alprotein)的序列,在 6383964606bp的位置多携带了一个 IS1 插入子(图 2)。2.4耐药基因注释在染色体上共检测到 3 个耐药基因:aadA1、sat-2、dfrA1,另外,尽管菌株没有表现出对测试的 2 种氟喹诺酮类药物的抗性,本研究在gyrA 基因上仍检测到了 gyrA-S83L 点突变,未发现gyrA 基因 87 位和 parC 基因 80 位的突变。在质粒pSh11sh529-2 上检测到 blaCTX-M-14、mphA、aac(3)-IId、dfrA17、aadA5、qacEdelta1、sul17 个耐药基因;在pSh11sh529-3 质粒上检测到了bl
24、aCTX-M-15基因(表2)。2.5可移动遗传元件分析整合子相关分析发现,在 dfrA17、aadA5、qacEdelta1、sul1 基因簇的上游158bp 的位置存在 1 个 intI1 整合子基因(图 1 和图 3),推测该基因簇的转移与 intI1 整合子相关。在 dfrA1、sat-2、aadA1 基因簇的上游 332bp 的位置存在 1 个 intI2 整合子(图 3),推测这 3 种基因的转移与 intI2 相关。在 blaCTX-M-14基因的上游 43bp 处存在 1 个 ISEcp1 插入子(图 1),blaCTX-M-15基因的上游313 bp 处 也 存 在 1 个
25、ISEcp1 插 入 子(图 2),mphA 基因上游 70bp 处存在一个 IS26 插入子(图 1)。3讨论本研究筛检到 2011 年上海市的 1 株同时对头孢菌素和阿奇霉素耐药的多重耐药宋内志贺菌Sh11sh529,对其基因组序列的分析发现,该菌株同时携带 2 种 ESBL 的编码基因 blaCTX-M-14和 blaCTX-M-15。以往携带 CTX-M 型 ESBL 志贺菌的相关研究,主要报道的是携带单一类型 ESBL 的菌株,而对同时携带 2 种 ESBL 基因的菌株报道较少910,2225,Liu 等6研究发现,新疆维吾尔自治区收集到的宋内志贺菌中同时携带 2 种 CTX 型 E
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