通过生物信息学分析克罗恩病差异表达基因和miRNA_陈世锔.pdf
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1、现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022,Vol27,No121537基础研究通过生物信息学分析克罗恩病差异表达基因和miNA陈世锔1,张大涯1,张发明2,陈润祥1,张晓冬1,白飞虎3,4【摘要】目的通过生物信息学分析寻找克罗恩病(Crohns disease,CD)的差异表达基因及其对应的 miNA,筛选参与 CD发展相关的潜在致病靶点,为寻找治疗新靶点提供参考依据。方法从 GEO 数据库下载基因芯片,通过分析工具 GEO2 分别对数据集进
2、行分组及分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并做线上 Venn 分析,进行 PPI、GO、KEGG 分析及miNA 预测。结果基因本体分析结果显示,DEGs 主要集中在炎症反应、中性粒细胞迁移、脂多糖应答、质外体、细胞外空间、细胞外基质、CXC 趋化因子受体结合、趋化因子活性、细胞外基质结构成分等方面,通路分析显示,DEGs 基因显著富集在 IL-17 信号通路、类风湿性关节炎通路、阿米巴病、百日咳、肿瘤坏死因子信号通路等方面。通过 Cytoscape 筛选出 10 个 hub 基因CXCL1、IL1B、TIMP1、CXCL8、IL6、M
3、MP1、SEPINE1、PTGS2、SPP1、MMP2。再利用 NetworkAnalyst3 0 在线数据库进行可视化分析,可推断 hsa-mir-124-3p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-146a-5p、hsa-mir-204-5p、hsa-mir-143-3p 等几种 microNA(miNA)可能在 CD的发生发展中起到关键性作用。结论在 CD 发病机制研究中,DEGs 与疾病的进展密切相关,可通过富集分析和 hub 基因筛选,以及相关 miNA 的推断分析为更深入研究 CD 的致病机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。【关键词】克罗恩病;GEO 数据库;生物信息学分析
4、;hub 基因;miNA中图分类号:574 62文献标志码:ADOI:10 3969/j issn 1672 2159 2022 12 010作者单位:1 571199 海南医学院研究生院;2 210011 南京医科大学第二附属医院消化内科;3 570216 海南医学院第二附属医院消化内科;4 570216 海南省消化疾病临床研究中心通信作者:白飞虎,E-mail:328473521 qq com基金项目:海南省临床医学中心建设项目资助(2021818);海南省院士团队创新中心建设项目资助(2022136);海南省院士创新平台科研项目资金资助(00817378);海南省卫生健康行业科研项目资助
5、(22A200078);海南省研究生创新科研课题(Qhyb2022-133);海南医学院研究生创新科研课题(HYYB2022A18)陈世锔和张大涯为共同第一作者Bioinformatic analysis of differentially expressed genes and miNAs in Crohns diseaseCHEN Shi-ju1,ZHANG Da-ya1,ZHANG Fa-ming2,ZHANG Xiao-dong1,CHEN un-xiang1,BAI Fei-hu3,41 Graduate School of Hainan Medical University,Hai
6、kou 571199,China;2 Department of Gastroenterology,The Second AffiliatedHospital of Nanjing Medical University Nanjing,210011,China;3 Department of Gastroenterology,The Second Affifiliated Hospital ofHainan Medical University,Haikou 570216,China;4 The Gastroenterology Clinical Medical Center of Haina
7、n Province,Haikou570216,China【Abstract】ObjectiveTo find differentially expressed genes and their corresponding miNAs in Crohns disease(CD)bybioinformatics analysis,to screen potential pathogenic targets involved in the development of CD,and to provide a reference for newtherapeutic targets MethodsTh
8、e gene microarrays were downloaded from the GEO database,and the data sets were grouped andanalysed for differentially expressed genes(DEGs)by GEO2 Online Venn analysis was done for PPI,GO,KEGG analysis andmiNA prediction esultsGene ontology analysis showed that DEGs were mainly concentrated in infl
9、ammatory response,neutrophilmigration,lipopolysaccharide response,plasmodesmata,extracellular space,extracellular matrix,CXC chemokine receptor binding,chemokine activity,structural components of extracellular matrix,etc Pathway analysis indicated DEGs were significantly enriched inIL-17 signalling
10、pathway,rheumatoid arthritis pathway,and signalling pathway of amoebiasis,pertussis and tumour necrosis factorTen hub genes CXCL1,IL1B,TIMP1,CXCL8,IL6,MMP1,SEPINE1,PTGS2,SPP1,MMP2 were screened by Cytoscape Hsa-mir-335-5p,hsa-mir-146a-5p,hsa-mir-204-5p,hsa-mir-143-3p and several other microNAs(miNAs
11、)may play a key role in thedevelopment of CD ConclusionDEGs are closely related to CD,Enrichment analysis and hub gene screening,as well as inferential1538现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022,Vol27,No12analysis of related miNAs,can provide
12、 theoretical basis for more in-depth study of the pathogenesis and new therapeutic targets of CD【Key words】Crohns disease;GEO database;bioinformatics analysis;hub gene;miNA克罗恩病(Crohns disease,CD)为炎症性肠病的一种,是一类终身性、复发性疾病,主要累及胃肠道,其病因和发病机制尚未完全明了。近年来全球患病率呈现逐年升高,从 1990年的 370 万增长至 2017 年的 680 万1,同样中国 CD 患者的
13、发病率也在逐年增加2。目前药物治疗主要包括 5-氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂,以及以抗 TNF-(tumornecrosis factor-,TNF-)为代表的生物制剂等。粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT),特别是其技术范畴内的洗涤菌群移植(washed microbiota transplantation,WMT),已经作为重建肠道微生态的有效手段,用于 CD 的治疗,收到了良好的效果3 4。然而,迄今为止全世界还没有用于 CD 诊断和预测疾病复发金标准的标志物。生物信息学是一门新兴学科,广泛用于阐明大量肿瘤和非肿瘤疾病的发病机制、早
14、期诊断和预后等大数据所包含的生物学意义5 6。单个微阵列分析具有较高的假阳性率,结果的可靠程度难以保障。因此,本研究我们通过 GEO 数据库下载了 3 个与 CD 相关的基因芯片数据集,并对其进行分析,以获得 CD 患者肠道炎症组织与健 康 人 肠 道 组 织 之 间 的 差 异 表 达 基 因(differentiallyexpressed genes,DEGs),对其进行富集分析,筛选出与 CD 相关的 hub 基因,再分析推断密切相关的 miNA,以期为进一步探讨 CD 可能的致病机制及其治疗新靶点提供新的研究思路和理论支持。1资料与方法1 1数据来源分别从 GEO 数据库(https:
15、/www ncbi nlmnih gov/geo/)下载 GPL6244 平台(Affymetrix Human Gene 1.0ST Array)生成的 GSE59071 和 GSE75214 数据集以 及由GPL570 平台(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)生成的 GSE186582 数据集。GSE59071 数据集包含 8 个 CD肠黏膜组织样本和 11 个健康对照;GSE75214 数据集包含 59个 CD 肠黏膜样本和 22 个健康对照;GSE186582 数据集包含来自 CD 患者的 196 份肠黏膜活检和来自对照组的 25
16、份肠黏膜组织(见表 1)。表 1有关 GEO 克罗恩病数据的详细信息eferencesGEOPlatformControlCDVanhove W(2015)GSE59071GLP6244118Vancamelbeke M(2017)GSE75214GLP62442259Ngollo M(2022)GSE186582GLP57025196Verstockt S(2019)GSE102133GLP624412651 2差异基因筛选从 GEO 数据库下载 GSE59071、GSE75214 和 GSE18658CD 相关基因芯片,通过分析工具 GEO2 分别对数据集进行分组及分析 DEGs,以 P
17、0.01,logFC(差异倍数 foldchange)1 或小于 1 为筛选条件分别获得上调、下调基因。再分别将上、下调基因进行线上 Venn 交集(http:/bioinformaticspsb ugent be/webtools/Venn/)进行可视化展示。1 3功能富集分析DAVID 数据库(http:/david abcc ncifcrf gov/)是一套非常完整的在线功能富集分析数据库,可帮助用户快速有效的获取基因背后的生物学信息,帮助理解其中的生物学意义。将筛选出的上调和下调的 DEGs 分别输入 DAVID 数据库进行基因本体(gene ontology,GO)分析与京都基因与基
18、因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。以 P 0.05 作为筛选条件,对于得到的富集分析结果借助 ImageGP 在 线 网 站(http:/www ehbio com/ImageGP/index php/Home/Index/index html)进行可视化。1 4蛋白互作网络分析将通过上述方法筛选获得的 DEGs 导入 String 数据库(https:/string-db org/),以最小互作评分 0.4 为筛选条件,构建蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络图。再通过 C
19、ytoscape310 0 进行可视化展示,同时计算节点的个数(node)以及连通度(degree)。利用 Cytoscape 插件 MCODE 进行模块划分,得到高度连通区域的子网,设置参数为 MCODEscores大于 18、Degree cut-off 值为 2、Node score cut-off 值为 0.2、K-score 值为2、Max depth 值为100。利用插件 cytoHubba 的 MCC算法获得联通度最大的 10 个基因作为 hub 基因。1 5验证 CD 数据集的 hub 基因表达从 GEO 数据库下载 GPL6244 平台(Affymetrix HumanGen
20、e 1.0 ST Array)生成的 GSE102133 数据集用于验证 hub 基因表达。该数据集包含65 个 CD 肠黏膜组织样本和12 个健康对照(见表 1)。以 P 0.01,logFC(差异倍数 foldchange)1或小于 1 为筛选条件分别获得上调、下调基因,最后再采用SPSS 26.0 制作 OC 曲线验证 hub 基因诊断效能。1 6Hub 基因相关的 miNAs利用 NetworkAnalyst3 0(https:/www networkanalystca/)进行可视化分析,预测可能与 hub 基因存在相互作用的miNA,构建 Gene-miNA 互作网络图。miNA 使
21、用的是miTarBase 数据库(http:/mirtarbase cuhk edu cn/php/)的数据。2结果2 1克罗恩病中 DEGs 的鉴定对微 阵 列 结 果 进 行 标 准 化 处 理 后,鉴 定 出 DEGs(GSE59071 中634 个,GSE75214 中358 个,GSE186582 中158个)(见图 1A C)。3 个数据集的重叠部分共包含 138 个基因(见图 2A),其中克罗恩病炎症组织与健康人正常组织间上调基因 113 个(见图 2B),下调基因 25 个(见图 2C)。2 2GO 分析和 KEGG 通路富集分析利用在线数据库 DAVID 进行功能以及途径富集
22、分析,并对其进行了生物学分类。其中 GO 分析显示,DEGs 生物过程(biological processes,BP)的变化在上调基因中显著富集于炎现代消化及介入诊疗2022 年 第27 卷 第12 期Modern Interventional Diagnosis and Treatment in Gastroenterology 2022,Vol27,No121539图 1DEGs 火山图,红色表示上调,绿色表示下调图 2关键基因筛选结果症反应、中性粒细胞趋化性、脂多糖应答等方面(表 2、图3A),而下调基因显著富集于饥饿反应、跨膜运输、蛋氨酸应答等方面(表 2、图 3B)。DEGs 细胞
23、组成(cellular components,CC)的变化在上调基因中显著富集于质外体、细胞外空间、细胞外基质等方面(表 2、图 3C),而在下调基因中显著富集在顶质膜、顶质膜外侧、刷状缘膜等方面(表 2、图 3D)。DEGs分子功能(molecular function,MF)的变化在上调基因中显著富集于 CXC 趋化因子受体结合、趋化因子活性、细胞外基质结构成分等方面(表 2、图 3E),而在下调基因主要富集于外生跨膜转运活性(表2、图3F)。KEGG 分析结果显示,上调的DEGs 显著富集在 IL-17 信号通路、类风湿性关节炎通路、阿米巴病、百日咳、TNF-信号通路等方面(表 2、图
24、3G),而下调 DEGs 则主要富集在胆汁分泌(表 2、图 3H)。表 2GO 分析和 KEGG 分析TermGO ID描述基因数目P 值UpregulatedGO:BPGO:0006954炎症反应28134E-21GO:BPGO:0030593中性粒细胞迁移14788E-16GO:BPGO:0071222脂多糖应答12380E-12GO:CCGO:0005576质外体59122E-28GO:CCGO:0005615细胞外空间54845E-26GO:CCGO:0031012细胞外基质19263E-15GO:MFGO:0045236CXC 趋化因子受体结合7147E-10GO:MFGO:0008
25、009趋化因子活性8135E-08GO:MFGO:0005201细胞外基质结构成分10976E-08GO:MFGO:0004252丝氨酸型内肽酶活性11161E-07KEGGhsa04657IL-17 信号通路14157E-12KEGGhsa05323类风湿性关节炎通路11888E-09KEGGhsa05146阿米巴病101293E-07KEGGhsa05133百日咳9357E-07KEGGhsa04668肿瘤坏死因子信号通路10654E-07DownregulatedGO:BPGO:0042594饥饿反应30001237GO:BPGO:0055085跨膜运输40003202GO:BPGO:1
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